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《山西医科大学》 2018年
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血管紧张素Ⅱ通过AT1R/StAR/AS/醛固酮信号通路参与调节心肌肥厚和心脏纤维化

张玮玮  
【摘要】:心肌肥厚和心脏纤维化在心血管疾病发生发展过程中至关重要。本课题组前期一直在探索肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)中重要的激素血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)及其受体在心脏纤维化过程中的作用及机制。传统用药血管紧张素转换酶抑制剂和1型血管紧张素Ⅱ受体(AT1R)阻断剂,虽能明显抑制心脏纤维化产生,但其副作用的存在影响临床治疗效果,因此探寻疗效相当但副作用小的临床治疗手段仍然迫在眉睫。依达拉奉是临床用于治疗脑卒中的自由基清除剂,报道显示它有抗炎和减轻心肌肥厚的作用,本研究旨在探索其抗纤维化的作用及分子机制。醛固酮(ALDO)是RAAS中Ang Ⅱ激活的下游因子,在肾上腺它的合成分泌主要通过类固醇合成急性调节蛋白(St AR)和醛固酮合成酶(AS)来调控,但其在心脏纤维化过程中的作用与机制仍未完全阐明。鉴此本课题通过采用胸主动脉缩窄和Ang Ⅱ皮下泵注模型,利用Western-blot、免疫组化、血流动力学测定和超声心动图等手段,旨在研究依达拉奉及Ang Ⅱ/AT1R/St AR/AS/ALDO信号途径在心脏纤维化过程中的作用机制,为临床治疗心脏纤维化提供新的治疗靶点。第一部分:依达拉奉通过调节Ang Ⅱ AT1R、AT2R/ACE2通路,改善压力后负荷增加引起的心肌肥厚及心功能异常目的:利用Ang Ⅱ AT1受体阻断剂替米沙坦作为阳性对照组,观察依达拉奉改善压力后负荷增加引起的心肌肥厚及心功能异常是否与下调AT1R,上调AT2R/ACE2表达有关。实验方法:1.分组:雄性SD大鼠行左开胸胸主动脉缩窄术(TAC),术后观察8周,分为4组,6只大鼠/组。(1)Sham组:大鼠开胸但不结扎胸主动脉。(2)TAC组:大鼠开胸在左右颈总动脉分支处结扎主动脉。(3)Edara组:在TAC模型基础上,腹腔注射依达拉奉(10mg/kg/day)8周。(4)Telmi组:在TAC模型基础上,胃饲替米沙坦(10mg/kg/day)8周。2.实验结束后,取大鼠心脏,计算心脏重量/体重(HW/BW)比值;心脏组织福尔马林固定、石蜡包埋后切片,HE染色后测定长轴心肌细胞横截面积(MSA)。3.大鼠心脏组织匀浆,通过丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒测定心脏MDA含量和SOD活性。4.心脏组织匀浆提取蛋白,Western-blot法测定AT1R、AT2R蛋白表达。5.石蜡组织切片使用免疫组化法对ACE2的组织定位和表达进行评估。6.实验结束后从右侧颈总动脉插入压力换能导管,记录左心室血流动力学变化。7.采用2D Vivid7超声仪对大鼠在体心功能进行测定。结果:1.TAC8周后,大鼠心肌MSA和HW/BW比值明显增加,依达拉奉和替米沙坦都可减小MSA和HW/BW比值。2.TAC8周后,大鼠心脏AT1R表达增多、AT2R/ACE2表达下调,同时MDA含量增加而SOD活性下降;依达拉奉和替米沙坦均可抑制AT1R表达上调、增加AT2R/ACE2表达,同时减小AT1R/AT2R比值(0.57±0.2 vs 3.16±0.39,p0.05),减少MDA含量和加强SOD活性。3.TAC8周后,大鼠心脏收缩功能下降,表现为射血分数(EF)以及左室收缩压(LVSP)下降。依达拉奉和替米沙坦均可改善心脏收缩功能,表现为增加EF(82%±3%vs 60%±5%)和LVSP(204±51 vs 110±19mm Hg,p0.05)。小结:在不影响外周血压的情况下,TAC8周可引起心肌肥厚和心功能下降。依达拉奉通过调节AT1R、AT2R/ACE2信号途径,减少自由基产生,减轻心肌肥厚和改善心功能,其作用和替米沙坦相同。第二部分:依达拉奉通过抑制TGF-β1/SMADs信号通路,减少巨噬细胞浸润和成纤维细胞转化,改善压力后负荷增加引起的心脏纤维化目的:探讨依达拉奉保护心脏纤维化的具体机制,是否通过减少巨噬细胞聚集,抑制TGF-β1/SMADs信号途径,减少成纤维细胞转化起到减轻心脏纤维化的作用。实验方法:1.大鼠TAC模型的制备、分组取材与第一部分内容相同。2.采用免疫组化法对大鼠心脏巨噬细胞、α-SMA肌成纤维细胞以及I型胶原蛋白在心脏组织及血管周围的表达进行定性评估。3.Western-blot法对大鼠心脏TGF-β1、Smad2、3、4、7和ⅡI型胶原蛋白表达进行定量测定。4.Masson’s三色染色法进行心脏及血管周围胶原纤维分布情况的测定。结果:1.胸主动脉缩窄8周之后,依达拉奉和替米沙坦可以减少巨噬细胞在心脏组织间隙聚集、减少TGF-β1蛋白的表达,进而减少成纤维细胞向表达α-SMA的肌成纤维细胞转化。2.依达拉奉和替米沙坦通过下调Smad2、3蛋白、上调Smad7蛋白的表达,最终抑制压力后负荷增加引起的I型胶原蛋白表达和胶原纤维在心脏组织间隙沉积。小结:不影响外周血压的情况下,压力后负荷增加导致心脏纤维化增加,依达拉奉与替米沙坦效果相同,通过抑制AT1R减少巨噬细胞聚集和成纤维细胞转化为肌成纤维细胞,同时调控TGF-β1/SMADs信号通路蛋白的表达,减轻心脏胶原沉积、逆转心脏纤维化形成。第三部分:心脏局部产生的醛固酮在Ang Ⅱ连续泵注诱导的心肌肥厚和心脏纤维化中的作用目的:通过采用盐皮质激素受体(MCR)阻断剂螺内酯、血管紧张素Ⅱ 1型受体(AT1R)阻断剂替米沙坦和肾上腺切除作为干预因素,阐明心脏局部产生的醛固酮(ALDO)在Ang Ⅱ诱导的心脏肥厚和纤维化过程中的作用原理。实验方法:1.雄性SD大鼠皮下放置Ang Ⅱ微量渗透泵4周,因不同的处理方式随机分为6组,6只大鼠/组,大鼠的组织提取、标本保存和石蜡包埋等过程与第一部分相同。(1)Sham组:皮下放置生理盐水微量渗透泵4周。(2)Ang Ⅱ组:皮下放置Ang Ⅱ微量渗透泵,泵注速度500ng/kg/min。(3)Telmi组:在Ang Ⅱ皮下泵注的基础上,胃饲替米沙坦10mg/kg/day 4周。(4)Spiron组:在Ang Ⅱ皮下泵注的基础上,胃饲罗内酯100mg/kg/day 4周。(5)T+S组:在Ang Ⅱ皮下泵注的基础上,联合胃饲替米沙坦和罗内酯4周。(6)ADX组:在Ang Ⅱ泵注的基础上,大鼠行双侧肾上腺切除术,观察4周。2.使用无创尾动脉压力测定法监测不同时间点大鼠动脉血压的变化。3.大鼠心肌MSA和HW/BW测定方法同第一部分。4.免疫组化法分析大鼠心脏巨噬细胞和肌成纤维细胞表达情况。5.Western-blot法对TGF-β1、Smad2/3、Collagen I、ⅡI的蛋白表达和磷酸化水平进行定量分析。6.Masson’s三色染色对大鼠心脏组织间隙和血管周围胶原纤维分布进行评估。结果:1.螺内酯、替米沙坦和肾上腺切除都可减轻心肌肥厚,但肾上腺切除后心肌肥厚仍明显存在,说明心脏局部产生的ALDO在Ang Ⅱ诱导的心肌肥厚中起重要作用。2.螺内酯、替米沙坦和肾上腺切除都可通过减轻巨噬细胞聚集、成纤维细胞转化,抑制TGF-β1/Smad2、3信号蛋白表达来逆转心脏纤维蛋白沉积和纤维化形成,但肾上腺切除后心脏纤维化仍明显存在,并且与螺内酯组有显著差异,说明心脏局部产生的ALDO在Ang Ⅱ引起的心脏纤维化过程中起更重要的作用。小结:在Ang Ⅱ直接泵注导致的心肌肥厚和心脏纤维化过程中,ALDO起到重要的作用,通过抑制ALDO产生的上游机制、阻断ALDO与盐皮质激素受体(MCR)相互作用,以及切除肾上腺减少肾上腺来源的ALDO都可不同程度减轻心脏纤维化。其具体机制是通过减少巨噬细胞聚集、成纤维细胞转化,进而抑制TGF-β1/Smad2、3信号通路逆转心脏I型胶原蛋白沉积和纤维化形成。由于切除肾上腺消除肾上腺来源的ALDO后,心脏纤维化仍然大量存在,并其效果与螺内酯组有显著差异,证明心脏局部产生的ALDO在这个过程中起更重要的作用。第四部分:类固醇合成急性调节蛋白/醛固酮合成酶在调控Ang Ⅱ诱导心脏醛固酮产生中的作用目的:比较螺内酯和替米沙坦的作用特征,探讨类固醇合成急性调节蛋白(St AR)和醛固酮合成酶(AS)在调控Ang Ⅱ诱导大鼠心脏醛固酮产生中的作用。实验方法:1.动物模型和分组与第三部分相同。2.Western-blot法测定大鼠心脏组织中AT1R、St AR、AS、ERK1/2、p38蛋白的表达及磷酸化水平,证明Ang Ⅱ诱导产生ALDO的上游信号分子及调控机制。3.免疫组化法分析大鼠心脏组织中TNF-α的表达及定位。Western-blot法测定心脏组织中Akt和MCP-1表达水平,证明ALDO诱导巨噬细胞聚集的信号途径。结果:1.替米沙坦通过阻断Ang Ⅱ与AT1R的相互作用抑制St AR和AS蛋白的表达。2.替米沙坦通过抑制ERK1/2/p38 MAPKs信号通路下调StAR的表达。3.螺内酯通过抑制TNF-α/Akt/MCP-1信号途径减少巨噬细胞趋化。小结:Ang Ⅱ诱导心脏局部ALDO产生过程中,St AR/AS起重要的作用且其表达上调是AT1R依赖性的,同时MAPKs信号通路可能参与其表达的调节;螺内酯通过阻断MCR受体,抑制TNF-α/Akt/MCP-1信号途径,从而减少巨噬细胞趋化聚集和纤维化形成。
【学位授予单位】:山西医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R54

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