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《山西医科大学》 2018年
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microRNA-223激活Akt通路在生理性心脏肥大中的作用

杨李旺  
【摘要】:目的:心脏肥大是心脏对血流动力学改变的一种适应性反应。高血压、瓣膜病等引起的心脏肥大是一种代偿反应,早期心脏功能增加,伴有心脏胚胎基因再表达,逐渐会发生间质纤维化、细胞凋亡增加,心功能下降,最终心脏衰竭,称为病理性心脏肥大。生理性心脏肥大是指后天的生长发育、妊娠、运动训练引起的心脏肥大,其心脏结构正常,无心脏胚胎基因再表达和间质纤维化,心功能正常或增加,这种肥大是可逆性的、且一般不会进展为心脏衰竭。microRNA是短链非编码RNA,通过与靶基因3’-UTR互补结合,在转录后水平调控mRNA的表达。microRNAs参与许多生理和病理过程的调节,关于microRNA与病理性心脏肥大的研究较多,但其与生理性心脏肥大的机制仍不十分清晰。本课题利用心脏特异过表达miR-223小鼠和miR-223过表达NRCM诱导心脏肥大,并进行了机制研究,可为临床治疗心脏肥大提供理论基础。方法:1.应用踏板运动训练诱导生理性心脏肥大小鼠模型,通过RT-PCR检测肥大心脏组织中miR-223表达水平。2.在α-MHC构建心脏特异表达的miR-223过表达小鼠模型中,观察HW/BW,进行WGA染色、Masson染色测定细胞大小及纤维化程度,利用RT-PCR测定纤维化标记物及心脏胚胎基因的表达水平,应用心脏超声检测LVPWd、LVPWs、IVSd、IVSs、EF、FS等指标。3.分离培养NRCM,构建Ad.miR-223及Ad.GFP并转染NRCM,通过免疫荧光染色观察过表达miR-223的NRCM细胞形态及大小。4.利用RNAseq检测miR-223 TG小鼠心脏中基因表达变化,并通过RT-PCR检测TG小鼠心脏及miR-223过表达NRCM中部分基因表达变化。5.利用western blot检测miR-223 TG小鼠心脏及miR-223过表达NRCM中Akt、磷酸化Akt等蛋白表达水平。6.通过荧光素酶实验验证FBXW7和Acvr2a是否为miR-223的靶基因。结果:1.4周踏车运动后,运动组小鼠表现为心脏肥大(运动组HW/BW为5.02±0.52,对照组为HW/BW4.23±0.18),且肥大心脏组织中miR-223表达增加(2.047±0.069,n=4,p0.05)。2.通过ɑ-MHC启动子建立心脏特异性过表达mi R-223小鼠模型,Line#6,Line#10和Line#15基因型鉴定为阳性,其中Line#6,Line#10成功传代。与WT比较,Line#6和Line#10的miR-223表达分别增加1300倍和600倍。3.与WT小鼠比较,TG小鼠HW/BW明显增加;WGA染色显示,TG小鼠心肌细胞明显增大;Masson染色显示,TG小鼠心脏无纤维化;RT-PCR结果显示,TG小鼠心脏纤维化基因标记物(Col I,Col III和CTGF)和病理性心脏肥大标记物(ANP,BNP,β-MHC和α-SKA)没有变化;血压测量结果显示,TG小鼠血压没有变化;超声结果,TG小鼠心脏IVSd、IVSs、EF、FS显著增加;TG小鼠运动持续时间明显延长。4.分离培养的NRCM,与Ad.GFP转染组比较,Ad.miR-223转染后24小时miR-223表达增加3.4倍,但没有对细胞大小产生影响;转染后48小时,miR-223增加71倍,而且细胞增大1.5倍。5.RNAseq结果显示,与WT比较,miR-223 TG小鼠心脏中81个基因表达上调,27个基因表达下调。RT-PCR验证了其中11个基因,结果与RNAseq基本一致。与Ad.GFP转染组比较,Ad.miR-223转染后24小时,NRCM中Postn和Rxfp1升高,Egln3降低,与TG心脏基因表达结果一致;转染后48小时,Atf3,Akip1,Ndrg4和Postn表达增加,而Egln3和Csq2表达降低,与TG心脏基因表达结果相似。6.Western blot结果显示,与Ad.GFP转染组比较,Ad.miR-223转染后24小时及48小时,Thr308和Ser473两个位点的磷酸化Akt水平均表达增高,且Akt磷酸化可被其特异性抑制剂MK2206抑制,同时细胞增大被抑制。7.荧光素酶报告显示,ACVR2a和FBXW7的3’-UTR包含代表mi R-223靶点的结合模板,是miR-223的靶基因。8.Western blot结果显示,miR-223过表达的NRCM和miR-223 TG小鼠心脏组织中ACVR2a、FBXW7及Egln3表达降低,Hif-1α和Postn的表达增加。结论:1.4周踏车运动训练诱导的生理性心脏肥大小鼠,心脏组织中miR-223表达增加。2.小鼠心脏及NRCM,miR-223过表达均可诱导生理性心肌肥大,且这种肥大是通过Akt磷酸化介导的。3.miR-223过表达通过FBXW7-Hif-1α-Postn和ACVR2a-Egln3-Hif-1α两个信号通路诱导了生理性心脏肥大。
【学位授予单位】:山西医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R54

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相关作者
>杨荣华
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