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《山西医科大学》 2018年
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新型脂肪因子CTRP3对糖尿病视网膜病变的筛查与保护作用及其机制研究

闫喆一  
【摘要】:研究背景:近年来调查研究表明,糖尿病(特别是Ⅱ型糖尿病)已成为继癌症心血管疾病后威胁人类健康的第三大杀手。据2017年中国糖尿病协会在中国人群中发病率的调查报告显示,我国已成为世界上糖尿病患者最多的国家。糖尿病常伴有糖尿病微循环异常,尤以眼底、肾小球、神经、心肌、肌肉等的微血管为主,引起眼底病变、肾脏病变、神经病变及心肌等病变,成为决定病人生存年限的主要因素。糖尿病视网膜病变(DR)作为糖尿病最常见的并发症之一,是造成糖尿病病人致盲的主要原因。然而临床上长期以来,糖尿病视网膜病变的筛查方法及有针对性的治疗药物匮乏。为了达到延长糖尿病病人生存年限,提高病人生活质量的目的,提供更简易的临床筛查方法及新的干预靶点有重要的理论意义和实践意义。CTRP3作为一个非常有潜力的诊断和治疗代谢综合征的手段成为近来的研究热点。有研究报道CTRP3可以激活Akt等信号通路减少糖尿病大血管内皮细胞的凋亡,保护血管内皮细胞功能。大量研究者认为,进一步揭示CTRP3对糖尿病血管内皮功能紊乱的作用机理对早期防治糖尿病性血管病变有重要意义,但其对微循环血管内皮的作用及其机制尚无人报道。研究目的:本研究将CTRP3应用到到微循环层面,深入分析CTRP3对DR血视网膜内屏障(iBRB)的保护作用及其及机制。为CTRP3成为糖尿病视网膜病变(DR)的临床筛查及干预的新思路及新靶点提供重要的理论依据。研究方法:本课题的研究方案主要从四个方面入手:(1)分析正常人群、糖尿病无并发症患者、严重程度不同的DR患者相关检测数据,从人群角度探讨CTRP3与DR病情严重程度的相关性,为CTRP3应用于糖尿病视网膜病变(DR)早期诊断、筛查提供依据;(2)建立iBRB体外模型,使用X-CELLigence系统及Transwell小室对示踪剂的通透性检测两种方法从功能学角度观察CTRP3对高糖高脂引起的iBRB屏障功能损伤的保护作用;(3)高糖高脂(HGHL)体外模拟DR损伤,给予视网膜微血管内皮细胞(HRMECs)CTRP3激活AMPK,siRNA阻断AMPK,western blot分析HRMECs中CTRP3作用的细胞内信号转导机制。(4)高脂饲料喂养联合链脲佐菌素腹腔注射(HFD/STZ)法建立2型糖尿病诱导的DR小鼠模型,FITC–Dextran联合FRITC-ConcanavalinA小鼠视网膜微血管染色及western blot体内实验验证CTRP3对糖尿病性iBRB损伤的抑制作用及其机制。结果:(1)在本研究中,我们首先发现T2DM患者血清CTRP3,CTRP5浓度明显低于对照组,且与NPDR相比,PDR组血清CTRP3,CTRP5浓度水平甚至更低(P0.001);随后,我们建立了单因素及多因素回归模型,发现只有CTRP3浓度与DR具有显著的独立关系(P0.05);之后,通过ROC和AUC分析发现CTRP3不仅可以作为DR的生物标志物(AUC为0.900,其95%的置信区间为0.838?0.962,P0.001),并且还CTRP3与DR病情严重程度呈负相关(AUC为0.919,其95%置信区间为0.850?0.989,P0.001)。这一发现有重要的理论及实际意义。最后,通过分析了CTRP3和协变量之间的相关性,发现在正常人群、T2DM患者、DR患者中,sVCAM-1与CTRP3稳定负相关(P0.001)。(2)建立iBRB体外模型,高糖高脂(HGHL)体外模拟DR损伤。使用X-CELLigence系统及Transwell小室对示踪剂的通透性检测两种方法检测iBRB的体外模型功能,结果稳定且有有一致性。HGHL造成了单层HRMECs的Cell Index值降低(P0.05)及其对于示踪剂FITC–Dextran通透性的增加(P0.05),即HGHL造成了iBRB的体外模型功能损伤。在整个实验过程中,应用CTRP3可以显著的减轻HGHL对于单层HRMECs造成的影响(P0.05),说明CTRP3对DR有保护作用,其作用机理是维护iBRB的屏障功能。(3)HRMECs与CTRP3(3μg/ml)一起孵育30分钟时,CTRP3激活了HRMECs中AMPK信号分子(P0.05),而对AKT信号分子没有明显的激活作用。HGHL体外模拟DR损伤导致ZO-1、Claudin1、Claudin5和Occludin表达显著降低(P0.05),而CTRP3的干预显著抑制了Occludin、Claudin5的表达显降低,结果均呈剂量依赖性(P0.05)。使用siRNA-AMPK阻断HRMECs细胞内源性AMPK的表达和释放后,这种抑制作用消失。siRNA-AMPK干预X-CELLigence系统检测各组iBRB体外模型的渗透性变化也证实了CTRP3通过AMPK/Occludin、Claudin5途径抑制HGHL诱导的炎的iBRB功能损伤(P0.05)。(4)HFD/STZ结合的方法,可以建立稳定2型糖尿病诱导的DR小鼠模型。HFD/STZ组小鼠视网膜铺片中出现iBRB屏障功能破坏及示踪剂FITC–Dextran渗漏,而HFD/STZ-DR(CTRP3)组示踪剂渗漏着染明显较少。说明CTRP3抑制了DR组小鼠的iBRB屏障功能损伤。通过western blot分析发现这种抑制作用靶点是Occludin、Claudin5(P0.05)。结论:(1)人群血清中CTRP3与DR病情严重程度呈负相关,CTRP3可以作为DR简易的临床筛查方法。(2)建立iBRB体外模型,使用X-CELLigence系统及Transwell小室对示踪剂的通透性检测两种方法均发现CTRP3可以抑制HGHL导致的的iBRB体外模型的屏障功能损伤。(3)体内体外实验均可证实,CTRP3通过AMPK/Occludin、Claudin5途径抑制DR导致的iBRB功能损伤。因此,本实验为CTRP3作为糖尿病重要的微循环病变——糖尿病视网膜病变(DR)的临床筛查及干预的新思路及新靶点提供了重要的理论依据。
【学位授予单位】:山西医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R587.2;R774.1

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