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《山西医科大学》 2018年
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基于全外显子捕获测序技术的心境障碍家系易感基因筛选及验证

杨春霞  
【摘要】:目的:心境障碍是一类危害性极大的复杂性疾病,探讨心境障碍发病机制意义重大,然而有关该复杂性疾病的发病机理还远未定论。遗传学研究显示其遗传度高达80%-85%,课题组基于目前心境障碍遗传学研究现状,假设心境障碍为一谱系疾病,可能存在共同的遗传基础,在同一家系中可能存在共同的致病突变。全外显子捕获测序(WES)选择基因组的编码序列进行测序,相对于全基因组测序(WGS)具有高效、经济、准确度高优点,适用于多因子复杂疾病的家系研究。本课题组选择心境障碍家系样本,采用全基因组外显子测序技术,筛选心境障碍候选易感基因/位点,进行细胞、动物水平及人群水平功能学验证,从遗传学角度探讨心境障碍发病机制。方法:1、心境障碍易感基因筛选选取一组4代心境障碍家系样本共32人,对该家系22例(9例心境障碍患者、13例对照)成员样本进行了全基因外显子捕获测序,筛选出心境障碍家系易感基因,并从生物信息学角度探讨其可能的生物学功能。2、人群验证(1)人群频率验证选取心境障碍患者307例,检测该家系中易感基因突变位点在散发心境障碍患者中的频率;(2)表达水平验证1)心境障碍家系:RT-qPCR检测原家系中携带/不携带有易感基因致病突变位点的成员m RNA表达水平,比较表达水平的差异;2)心境障碍散发患者:对22例散发未用药抑郁障碍患者进行表达水平验证,同期收集22名正常健康对照。病例组规范化抗抑郁药物治疗8周。进行外周血MAPKAP1表达异常在病例对照之间及治疗前后的比较分析。3、细胞水平验证选取人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)细胞系,对SH-SY5Y细胞进行N.C.siRNA和MAPKAP1-siRNA病毒转染,Real-Time qPCR、western-blot检测易感基因和其作用靶点及其信号传导通路相关基因表达量,比较其表达水平有无差异,探讨易感基因在神经细胞中可能的生物学功能。4、MAPKAP1信号通路与心境障碍分析(1)动物水平GEO数据库中提取编号为GDS5307的数据,对19例小鼠大脑(11例抑郁小鼠,其中7例抗抑郁治疗有效,4例抗抑郁治疗阻抗,8例正常对照小鼠)前额叶背侧、腹侧脑组织中检测MAPKAP1及其相关通路基因的RNA表达水平。(2)人群水平1)人群外周血样本GPL10558数据GEO数据库中提取编号为GPL10558数据,29例病例(21例MDD,8例BD)和24例性别、年龄均匹配的健康对照,对53例病例对照样本的外周血MAPKAP1、AKT1、GSK3B和β-catenin的RNA表达水平进行差异分析。2)人群脑组织样本GSE53987数据GEO数据库中提取编号为GSE53987及GSE53987数据,34例病例(17例MDD,17例BD)和19例性别、年龄均匹配的健康对照,对53例病例对照样本中大脑前额叶组织及海马组织MAPKAP1、AKT1、GSK3B和β-catenin的RNA表达水平进行差异分析。结果:1、心境障碍易感基因筛选根据Medel Scan软件的分析结果,对初筛的26个心境障碍易感候选基因按增加疾病易感性的可能性大小排序,排在首位的是MAPKAP1基因,该基因是mTORC2的独特成分,mTORC2能磷酸化Akt的S473位点激活Akt,而激活的Akt通过雷帕霉素靶蛋白信号通路(PI3K/Akt/mTORC2)发挥神经可塑性生物学功能,在大脑中影响着神经干细胞的分裂、神经环路的形成、神经可塑性等功能,其变异与许多神经精神疾病发生、发展相关。因此,MAPKAP1可能通过mTORC2通路介导神经可塑性参与了心境障碍的发生、发展。2、人群验证(1)人群频率验证利用在线千人计划数据库信息获得正常成人的位点突变资料与抑郁障碍患者进行比较。307例病例组的rs78809014等位基因G突变频率为6.1%,高于CHB正常人群4.4%;明显高于CHB+CHS3.1%(χ2=4.57,P=0.03);明显高于ESA2.8%(χ2=10.50,P=0.001)。数量性状分析显示MAPKAP1基因多态性与认知障碍因子及认知障碍因子中有罪感和自杀有关联(P0.05),携带有G等位基因的患者认知障碍因子、有罪感及自杀分值明显高于携带有C等位基因者。(2)表达水平验证1)MAPKAP1的RNA表达水平在病例组明显高于对照组(t=-3.654,P=0.001),经过8周抗抑郁药物治疗,MAPKAP1表达水平明显减低(t=-2.105,P=0.048),但仍高于对照组(t=-2.131,P=0.039);2)MAPKAP1与HAMD-17总分无相关性,与阻滞因子存在正相关关系(r=-0.444,P=0.038),与组成阻滞因子的抑郁情绪评分存在正相关关系(r=-0.470,P=0.027);3)MAPKAP1与即刻记忆存在负相关关系(r=-0.531,P0.001),与视觉广度存在负相关关系(r=-0.456,P=0.002),与连线1时间存在正相关关系(r=0.425,P=0.004)。3、细胞验证:(1)MAPKAP表达水平在MAPKAP1-siRNA组细胞比N.C.siRNA组细胞明显降低。且GSK3B、β-catenin也较N.C.siRNA组降低,具有统计学意义,说明MAPKAP1表达降低可引起通路相关基因表达在SH-SY5Y中发生变化;(2)AKT1及磷酸化AKT1蛋白表达在细胞正常组细胞、N.C.siRNA组细胞和MAPKAP1-siRNA三组细胞间比较,结果显示,磷酸化AKT1蛋白表达在MAPKAP1-siRNA细胞灰度明显降低。4、MAPKAP1信号通路与心境障碍(1)动物水平抑郁小鼠与正常对照MAPKAP1及通路相关基因在小鼠大脑前额叶腹侧脑RNA表达水平差异比较:MAPKAP1表达在抑郁小鼠中表达组明显高于正常对照组(t=-3.216,P=0.005),MAPKAP1表达抗抑郁治疗有效组高于抗抑郁治疗阻抗组(t=-2.055,P=0.070)、明显高于正常对照组(t=4.946,P0.001)。小鼠大脑前额叶腹侧MAPKAP1表达与GSK3B(r=0.463,P=0.046)、β-catenin(r=0.838,P0.001)表达存在正相关关系。(2)人群水平1)病例对照外周血检测病例对照外周血MAPKAP1表达无统计学差异,但病例组表达高于对照组,MAPKAP1与AKT1存在正相关关系(r=0.427,P=0.001),与GSK3B存在正相关关系(r=0.327,P=0.017),与β-catenin存在正相关关系(r=0.359,P=0.008)。2)病例对照大脑海马组织检测MAPKAP1表达在病例中存在升高趋势(t=-1.874,P=0.067),AKT1病例组大脑海马组织表达明显高于对照组(Z=-2.592,P=0.010)。3)病例对照大脑前额叶组织检测病例对照大脑前额叶组织MAPKAP1表达无统计学差异,但病例组表达高于对照组,MAPKAP1与AKT1存在正相关关系(r=0.364,P=0.007)。结论:1、MAPKAP1基因可能是心境障碍的易感基因;通过(PI3K/Akt/mTORC2)通路发挥其神经可塑性生物学功能参与心境障碍的发生、发展。2、心境障碍患者携带较高频率的rs78809014G等位基因,且与临床症状中有罪感和自杀相关。3、心境障碍患者存在MAPKAP1表达的异常,且与抗抑郁治疗相关。MAPKAP1表达异常与临床症状中阻滞因子(抑郁情绪)正相关;MAPKAP1高表达者具有较差的即刻记忆。4、抑郁小鼠模型大脑前额叶腹侧脑组织MAPKAP1高表达组抗抑郁治疗效果好。
【学位授予单位】:山西医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R749

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