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《山西医科大学》 2018年
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长链非编码RNA AP003419.16调控RPS6KB2对衰老相关特发性肺纤维化的机制研究

郝小燕  
【摘要】:目的:通过转录组测序和生物信息学技术,筛选出与特发性肺纤维化(IPF)相关的差异表达的lncRNA,并进行验证其可否成为IPF相关的分子靶点,进而在动物水平及细胞水平研究该lncRNA的功能,并探讨其在IPF中可能的作用机制。方法:1.(1)根据诊断标准收集年龄大于60岁的IPF患者的外周血标本和年龄大于60岁的正常对照血液标本各4例,通过转录组测序技术检测外周血的lncRNAs,通过生物信息学技术分析差异表达lncRNAs和mRNAs情况。(2)再次收集IPF组30例和对照组30例,留取外周血提取RNA,进行PCR验证前期筛选出的lncRNAs,比较两组之间lncRNAs的表达情况,选出两组之间变化比较大的lncRNA进行研究。同时验证该lncRNA和与其相关的mRNA的表达情况。(3)同时收集不同年龄的健康人群的外周血标本100例,20-30岁20例,30-40岁20例,40-50岁20例,50-60岁20例,大于60岁20例,通过PCR检验AP003419.16、RPS6KB2在不同年龄人群的表达。2.动物水平:通过生物信息学分析发现AP003419.16、RPS6KB2在人与鼠之间的同源性很高。我们选用6周和6月龄的雄性C57BL/6小鼠进行实验,6周龄小鼠采用随机数字法分为正常组(QC组)、青年肺纤维化组(QM组)、青年肺纤维化+雷帕霉素组(QL组),每组12只。6月龄小鼠采用随机数字法分为正常老龄组(LC组)、老龄肺纤维化组(LM组)、老龄肺纤维化+雷帕霉素组(LL组),每组12只。HE染色观察肺组织损伤情况,Masson染色观察肺纤维化情况,原位杂交方法检测AP003419.16在肺组织的表达情况。PCR方法检测外周血和肺组织AP003419.16、RPS6KB2表达水平。Western blot方法检测肺组织P-P70S6K蛋白的表达情况。3.细胞水平:(1)培养A549细胞,分组:A549组、TGF-β1干预组、A549组(7d)、TGF-β1干预(7d)组。通过β-半乳糖苷酶实验法检测细胞衰老。PCR检测AP003419.16和RPS6KB2的表达。Western blot方法检测P-P70S6K的表达。(2)通过siRNA干扰掉AP003419.16,根据实验分为6组:A549组、TGF-β1干预组(A549_(TGF-β1)组)、阴性siRNA组(A549_(阴性siRNA)组)、阴性si RNA+TGF-β1干预组(A549_(阴性siRNA+TGF-β1)组)、阳性siRNA组(A549_(阳性siRNA)组)、阳性siRNA+TGF-β1干预组(A549_(阳性siRNA+TGF-β1)组)。PCR检测AP003419.16和RPS6KB2的表达。结果:1.(1)转录组测序结果发现在IPF中存在差异表达的lncRNAs。与对照组相比,IPF中差异表达的lncRNA共有1699条。GO分析发现IPF中相关的靶基因功能,如参与了调节B细胞受体信号通路、调节钙通道活性等,Pathway分析发现IPF相关的靶基因相关的信号通路主要有mTOR信号通路、ErbB信号通路等。IPF中差异表达的lncRNA与邻近蛋白编码基因的位置关系为正义、反义、基因间所占的比例比较大。根据测序的结果及筛选条件,我们选出3个lncRNAs:AP003419.16、RASSF1-AS1、RP11-20I23.8。(2)扩大样本IPF组30例及对照组30例进行PCR验证这3个lncRNAs,结果发现AP003419.16变化倍数比较大,我们将选用AP003419.16进行下一步研究,生物信息学分析发现差异表达的mRNA为RPS6KB2,是AP003419.16的邻近基因。PCR验证后发现AP003419.16和RPS6KB2在IPF中高表达,而在对照组中低表达(P0.05)。(3)AP003419.16、RPS6KB2的表达随着年龄的增长而增加(P0.05)。2.HE染色和Masson染色发现肺间质增厚和纤维化程度在LM组最明显,QL组较QM组好转,LL组较LM组好转。原位杂交结果显示,AP003419.16在LC组较QC组表达增高(P0.05),QM组较QC组表达量增高,LM组较LC组表达量增高,LM组表达量最高(P0.05),QL组较QM组表达量减少,LL组较LM组表达量减少(P0.05)。PCR检测C57BL/6小鼠外周血及肺组织发现AP003419.16、RPS6KB2在LC组较QC组表达增高(P0.05),QM组较QC组表达量增高,LM组较LC组表达量增高,LM组表达量最高(P0.05),QL组较QM组表达量减少,LL组较LM组表达量减少(P0.05)。Western Blot检测各组肺组织中P-P70S6K的表达结果与基因RPS6KB2表达结果一致(P0.05)。3.倒置相差显微镜观察A459细胞,TGF-β1干预7天后,A459细胞形态由原来的多角形逐渐变为长梭形,并且发现TGF-β1干预7天后,β-半乳糖苷酶着色阳性的细胞明显增多。(1)PCR结果显示AP003419.16和RPS6KB2的表达在TGF-β1干预组较A549组增加(P0.05)。A549组(7d)较A549组增加(P0.05)。TGF-β1干预(7d)组表达量最多(P0.05)。Western Blot检测各组肺组织中P-P70S6K的表达结果与基因RPS6KB2表达结果一致(P0.05)。(2)生物信息学分析发现AP003419.16和RPS6KB2之间的关系可能存在重叠关系。PCR结果发现利用siRNA干扰AP003419.16后,RPS6KB2基本不表达。结论:1.转录组测序结果显示在IPF患者外周血中存在差异表达的lncRNAs,其中AP003419.16和它的邻近基因mRNA RPS6KB2表达在IPF中高表达,而在对照组中低表达。AP003419.16和RPS6KB2随着年龄的增长而表达增加。2.动物模型中的外周血及肺组织中均发现AP003419.16和RPS6KB2与衰老及IPF相关。3.生物信息学分析发现AP003419.16和RPS6KB2之间的关系可能存在重叠关系。细胞水平发现利用siRNA干扰AP003419.16后,RPS6KB2基本不表达。我们推测长链非编码RNAAP003419.16可能通过调控邻近基因RPS6KB2在衰老相关特发性肺纤维化的发生中发挥潜在的分子靶点。
【学位授予单位】:山西医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R563

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