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《山西医科大学》 2018年
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基于磁性有序介孔碳靶向给药系统的制备及其体外抗肿瘤活性的研究

杜晶磊  
【摘要】:目的:构建基于磁性有序介孔碳纳米球的靶向给药系统,研究其生物相容性、安全性和对肿瘤细胞的增殖抑制作用及靶向性。方法:1.采用软模板制备有序介孔碳纳米球(OMCNs),以Fe(NO_3)_3·9H_2O为铁源,浸渍法制备磁性有序介孔碳纳米球(MOMCNs),并用对羧基苯肼、碳化二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酸亚胺(NHS)等处理,制备含肼基的磁性有序介孔碳纳米球载体(HMOMCNs),表征其粒径、形貌、比表面积及磁性等理化性质。2.采用EDC-NHS将叶酸(FA)修饰到HMOMCNs表面制备叶酸化肼基磁性有序介孔碳纳米球(HMOMCNs@FA)。选用抗肿瘤药物阿霉素(DOX)为模板药物分子,利用载体的物理吸附和化学键的共同作用,构建纳米载药复合体HMOMCNs@DOX@FA。采用紫外分光光度计(UV-vis)考察纳米载药复合体的体外载释药性能。3.选用新鲜抗凝健康人血,以生理盐水和蒸馏水分别为阴性对照组和阳性对照组,采用UV-vis检测不同浓度的HMOMCNs@FA和HMOMCNs的溶血率,考察纳米药物载体的生物相容性。4.分别选用大鼠肺上皮细胞(RLE-6TN)和人宫颈癌细胞(Hela)为效应细胞,采用CCK-8法检测不同浓度的HMOMCNs和HMOMCNs@FA对细胞的24、48、72 h的相对存活率,考察纳米载体对两种细胞的毒性作用。5.选用Hela细胞为效应细胞,采用流式细胞仪考察不同浓度的HMOMCNs@FA诱导细胞凋亡的能力,进一步评价HMOMCNs@FA的细胞毒性。6.选用Hela细胞为效应细胞,以单纯DOX组为对照,采用CCK-8法分别检测24、48 h不同浓度的HMOMCNs@DOX和HMOMCNs@DOX@FA对肿瘤细胞的增殖抑制作用,并在倒置光学显微镜下观察药物作用后细胞形态的变化,考察纳米载药复合体的抗肿瘤活性。7.选用Hela细胞为效应细胞,采用倒置荧光显微镜观察和比较三种药物组(单纯DOX组、HMOMCNs@DOX组、HMOMCNs@DOX@FA组)在相同药物浓度(含DOX终浓度为4μg/mL)、相同培育时间内Hela细胞胞内的DOX的荧光强度,定性考察经FA修饰后的纳米载药复合体的肿瘤靶向性。结果:1.场发射扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察,HMOMCNs呈球形,表面规则,粒径均一,基本呈单颗粒分散,平均粒径大约为104 nm,而且可见其表面有序的孔道结构;采用FTIR技术对HMOMCNs和MOMCNs的表面官能团结构表征可知,HMOMCNs在1635 cm~(﹣1)处的特征峰代表苯环和酰胺键,与MOMCNs的吸收光谱相比,二者的特征吸收峰重合;HMOMCNs与MOMCNs的N_2吸附-脱附曲线的类别相同,属于介孔材料,与MOMCNs的S_(BET)相比,HMOMCNs的S_(BET)降低为52.79 m~2/g;HMOMCNs具有明显的磁性特征。2.通过计算,制备得到的HMOMCNs@FA对FA的平均修饰量为64.82 mg·g~(-1)。HMOMCNs@FA和HMOMCNs对DOX的载药曲线显示,HMOMCNs@FA和HMOMCNs对DOX的负载量随其浓度的变化,呈上升趋势;HMOMCNs在DOX浓度为500μg/mL时,负载量趋于平衡,载药量为529.18 mg/g,而HMOMCNs@FA未出现平缓期,载药量可达577.12 mg/g。HMOMCNs@DOX@FA的体外释药曲线结果显示:在不同pH的PBS溶液中释药率不同,当pH为5.6时,释药时间为30 h的释药率可达到20%以上,而pH为7.4和8.0的释药率不足5%,且释药速率不及pH为5.6时。表明HMOMCNs@DOX@FA的释药具有pH敏感性,在酸性环境中易释放,而在碱性环境中较稳定,不易释药。3.溶血实验结果显示,HMOMCNs和HMOMCNs@FA的各浓度组溶血率均小于5%,而且与蒸馏水组相比,P0.05,差异有显著性,说明载体材料符合医用材料溶血率的要求。4.CCK-8法评价HMOMCNs和HMOMCNs@FA对RLE-6TN细胞和Hela细胞的毒性作用结果显示,在载体浓度25μg/mL时,HMOMCNs和HMOMCNs@FA对两种细胞几乎没有抑制作用,相对存活率可达到95%以上;从载体浓度25μg/mL开始,随着两种载体浓度的增加,Hela细胞和RLE-6TN细胞的相对存活率逐渐降低,存在浓度依赖性;且与对照组相比较,载体浓度为50、75、100和200μg/mL四组的细胞相对存活率差异有统计学意义(P0.05)。同时,HMOMCNs@FA浓度为100μg/mL,反应时间72 h后,RLE-6TN细胞和Hela细胞的相对存活率仍可达到68.9±4%和70.6±3.9%,表明HMOMCNs和HMOMCNs@FA具有良好的生物安全性。而且,药物载体浓度相同时,对比48 h、72 h的细胞相对存活率与24 h的相对存活率,差异无显著性。5.采用流式细胞仪检测HMOMCNs@FA对Hela细胞24 h的存活率结果显示,在载体浓度25μg/mL时,细胞的存活率可达到92.69±1.34%;载体浓度为50、75、100、200μg/mL组与对照组相比,细胞存活率的差异均有统计学意义(P0.05),结果与CCK-8法所得结果基本符合。6.CCK-8法评价DOX、HMOMCNs@DOX和HMOMCNs@DOX@FA对Hela细胞的增殖抑制作用。结果显示,三种药物组对Hela细胞的增殖抑制作用具有时间和浓度依赖性,随着药物作用时间和药物组浓度的增大,细胞存活率逐渐下降;药物组作用于Hela细胞24 h后,药物浓度在~1μg/mL时,DOX组对Hela细胞的增殖抑制作用强于HMOMCNs@DOX组和HMOMCNs@DOX@FA组。HMOMCNs@DOX组和HMOMCNs@DOX@FA组相比在作用细胞24 h后差异不显著;药物组作用于Hela细胞48 h后,药物浓度在~1μg/mL时,HMOMCNs@DOX@FA组对Hela细胞的增殖抑制作用强于HMOMCNs@DOX组和DOX组;药物浓度为2μg/mL时,HMOMCNs@DOX@FA和DOX组对Hela细胞的增殖抑制作用强于HMOMCNs@DOX组。7.细胞摄取实验结果显示,HMOMCNs@DOX@FA组的Hela细胞胞内红色荧光强度明显强于DOX组和HMOMCNs@DOX组。表明经FA修饰的HMOMCNs可作为DOX的药物载体通过靶向Hela细胞表面的FA受体将其递送到Hela细胞内,从而增加Hela细胞对DOX的摄取。结论:1.制备的HMOMCNs形貌规则,粒径在100 nm左右,磁性特征明显,表面具有丰富的官能团结构以及较大的比表面积,经FA修饰的HMOMCNs对DOX有较高的负载量。2.成功构建的HMOMCNs@DOX@FA靶向载药复合体具有一定的pH敏感性。3.纳米药物载体HMOMCNs和HMOMCNs@FA具有良好的生物相容性和较低的毒性作用。4.HMOMCNs@DOX@FA能够更有效地抑制Hela细胞的增殖,具有良好的缓释性和靶向性。
【学位授予单位】:山西医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R943;R965

【参考文献】
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