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《山西医科大学》 2018年
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大气PM_(2.5)对SH-SY5Y细胞能量代谢的影响

班红芳  
【摘要】:目的:研究大气细颗粒物(PM_(2.5))对人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)能量代谢的影响,分析其与细胞存活率、氧化应激水平及细胞凋亡之间的关系,为研究PM_(2.5)神经毒作用机制提供依据。方法:细胞培养及染毒:选取SH-SY5Y细胞常规培养,待细胞汇合度约80%时,用0.25%胰酶消化,进行细胞接种。分别以终浓度0、20、80、320μg/mL PM_(2.5)剂量组对SH-SY5Y细胞染毒24h,观察PM_(2.5)对SH-SY5Y细胞毒性的剂量反应关系。选取0、80μg/mLPM_(2.5)组和BHA(3-tert-Butyl-4-hydroxyanisole)干预组(80μg/mLPM_(2.5)与20μmol/L BHA共培养)处理SH-SY5Y细胞24、48、72h,观察PM_(2.5)对SH-SY5Y细胞毒性的时效关系及BHA的干预效果。选取0、80μg/mLPM_(2.5)染毒SH-SY5Y细胞24、48、72h后,分别弃去染毒液,更换新鲜培养液继续培养24h,观察染毒不同时间PM_(2.5)后SH-SY5Y细胞的恢复效应。能量代谢指标检测:利用XFp细胞能量代谢分析仪测量OCR(细胞耗氧率)来检测线粒体呼吸功能,以及测量ECAR(胞外酸化率)来检测糖酵解功能。细胞损伤指标的检测:MTT法检测SH-SY5Y细胞存活率,TBA法检测细胞MDA含量,黄嘌呤氧化酶法检测细胞T-SOD活力、CuZn-SOD活力及Mn-SOD活力,流式细胞术检测ROS水平、线粒体膜电位变化和细胞凋亡水平。结果:细胞能量代谢检测结果:随染毒剂量的增加,SH-SY5Y细胞基础耗氧率、ATP偶联的有氧呼吸速率、质子漏耗氧速率、有氧呼吸最大值、有氧呼吸储备值、糖酵解水平及糖酵解能力最大值均呈下降的趋势(P_(趋势)0.05);各染毒组细胞基础耗氧率和ATP偶联的有氧呼吸速率与对照组相比,均具有统计学意义(P0.05);80、320μg/m L染毒组细胞有氧呼吸最大值、有氧呼吸储备值、糖酵解水平及糖酵解能力最大值,与对照组相比差异具有统计学意义(P0.05)。80μg/m LPM_(2.5)组随染毒时间增加,细胞基础耗氧率、ATP偶联的有氧呼吸速率、质子漏耗氧速率和有氧呼吸最大值逐渐降低;染毒48后,与染毒24h组相比基础耗氧率、有氧呼吸最大值及糖酵解水平差异具有统计学意义(P0.05);染毒72h后,与染毒24h组相比基础耗氧率、ATP偶联的有氧呼吸速率、质子漏耗氧速率、有氧呼吸最大值、糖酵解水平及糖酵解能力最大值差异具有统计学意义(P0.05)。染毒72h恢复组有氧呼吸储备值下降,与对应浓度的PM_(2.5)组比较,差异具有统计学意义(P0.05)。细胞氧化及抗氧化水平检测结果:随着PM_(2.5)染毒剂量的增加,SH-SY5Y细胞存活率、T-SOD活力、CuZn-SOD活力及Mn-SOD活力呈下降趋势(P_(趋势)0.01),MDA含量、ROS含量、线粒体膜电位的下降率、细胞早期凋亡率和总凋亡率呈上升趋势(P_(趋势)0.01);各剂量组细胞存活率、T-SOD活力、Mn-SOD活力、ROS含量、线粒体膜电位下降率、细胞早期凋亡率及总凋亡率与对照组相比差异均具有统计学意义(P0.05),80、320μg/m LPM_(2.5)组MDA含量及CuZn-SOD活力与对照组相比,差异具有统计学意义(P0.05)。80μg/mLPM_(2.5)染毒组,随染毒时间的增加SH-SY5Y细胞存活率和Mn-SOD活力逐渐下降,MDA含量、ROS含量、线粒体膜电位的下降率、细胞早期凋亡率和总凋亡率逐渐上升,与24h组相比差异均具有统计学意义(P0.05)。染毒24h恢复组降低了细胞存活率,增加了线粒体膜电位的下降率,与对应浓度的PM_(2.5)组比较,差异具有统计学意义(P0.05);染毒48h恢复组增加了细胞MDA含量和线粒体膜电位的下降率,与对应浓度的PM_(2.5)组比较,差异具有统计学意义(P0.05)。抗氧化剂BHA干预结果:BHA干预24h组可以显著升高基础耗氧率、ATP偶联的有氧呼吸速率、有氧呼吸最大值和有氧呼吸储备值(P0.05);BHA干预48h组可以显著升高ATP偶联的有氧呼吸速率、质子漏耗氧速率和有氧呼吸储备值(P0.05)。同时,BHA干预24h组时可以显著升高细胞存活率、T-SOD活力、CuZn-SOD活力及Mn-SOD活力,降低MDA含量和ROS含量(P0.05);BHA干预24h、48h、72h组均可以显著降低线粒体膜电位的下降率、细胞早期凋亡率和总凋亡率(P0.05)。能量代谢各指标与细胞损伤指标的相关关系:SH-SY5Y细胞基础耗氧率、ATP偶联的有氧呼吸速率、质子漏耗氧速率、有氧呼吸最大值、有氧呼吸储备值、糖酵解水平和糖酵解能力最大值与细胞存活率、T-SOD活力、CuZn-SOD活力及Mn-SOD活力呈正相关,与MDA值、ROS含量、线粒体膜电位的下降率、细胞早期凋亡率及总凋亡率呈负相关,且均具有统计学意义(P0.05)。结论:PM_(2.5)可引起SH-SY5Y细胞线粒体呼吸功能损伤且存在剂量及时间依赖性,中高剂量可以引起线粒体呼吸储备能力及糖酵解功能的降低;脱离暴露24小时后能量的损伤持续存在;PM_(2.5)也可以引起细胞氧化损伤、抗氧化能力降低及细胞凋亡且存在剂量及时间依赖性;抗氧化剂BHA干预24h后可以逆转PM_(2.5)对线粒体呼吸功能的损伤。PM_(2.5)导致SH-SY5Y细胞能量代谢的紊乱可能与氧化损伤有关,能量代谢的紊乱可能最终引起细胞凋亡。
【学位授予单位】:山西医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:X513;R122

【参考文献】
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