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《山西医科大学》 2019年
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胆碱衍生物修饰的蒿醚林酸复合物纳米脂质体的药动学及药效学评价

段帅  
【摘要】:目的:疟原虫感染的红细胞和恶性肿瘤细胞的通性是胆碱代谢异常,基于此,本课题以胆碱衍生物为靶头,合成胆碱衍生物修饰的蒿醚林酸复合物(artelinic acid-choline derivative,AD);制备胆碱衍生物修饰的蒿醚林酸复合物纳米脂质体(ADLs),并对其进行单因素处方优化,考察其制剂学性质;对ADLs在大鼠体内的药动学进行初步的研究并分别评价ADLs对约氏鼠疟(Plasmodium yoelii BY265,PyBY265)的抗疟活性和ADLs对小鼠乳腺癌4T1细胞的体内外抗肿瘤活性。方法:1.胆碱衍生物修饰的蒿醚林酸复合物的合成及表征以双氢青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)为原料药,通过脱水缩合反应、水解反应合成蒿醚林酸(artelinic acid,AA),AA与季铵化胆碱衍生物通过酯化反应得到胆碱衍生物修饰的蒿醚林酸复合物(AD)。采用傅立叶变换离子回旋共振质谱(FT-ICR MS)和核磁共振氢谱、碳谱(~1H-NMR,~(13)C-NMR)确证其结构。2.胆碱衍生物修饰的蒿醚林酸复合物脂质体的制备及处方优化用高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)建立AD的体外分析方法;采用薄膜分散法制备ADLs,以包封率(encapsulation efficiency,EE)、载药量(drug loading efficiency,DL)、粒径(size)及多分散性指数(polydispersity index,PDI)为评价指标,考察药脂比、水化温度以及胆固醇的用量对脂质体处方的影响,以获得较优处方。通过透射电镜(transmission electron microscopy,TEM)观察ADLs的表面形态,超滤离心法测定脂质体的包封率,体外透析法测定脂质体的体外释放,并考察ADLs在一月内的稳定性。3.胆碱衍生物修饰的蒿醚林酸复合物脂质体在大鼠体内的药动学研究建立高效液相色谱-质谱联用法(high performance liquid chromatography-mass spectrometry,HPLC-MS/MS)测定大鼠血浆中AD和AA的含量。将24只雄性SD大鼠随机分为4组(n=6),分别静脉注射蒿醚林酸溶液(AA-SOL)、蒿醚林酸脂质体(AALs)、AD溶液(AD-SOL)、ADLs,并分别于0.083,0.167,0.25,0.5,0.75,1,2,4,6,8,12和24 h眼眶取血0.5 ml于肝素管,在3500 r/min离心10 min以分离血浆,将上层血浆保存于-20℃冰箱中直至测定分析。4.胆碱衍生物修饰的蒿醚林酸复合物脂质体的体内抗疟药效学研究以PyBY265感染小鼠为模型,以不治疗组、空白脂质体组为阴性对照组,以双氢青蒿素脂质体组(DHALs)、蒿醚林酸脂质体组(AALS)、胆碱衍生物脂质体组(CDLS)、AALs和CDLs的等摩尔物理混合脂质体组(AALs-CDLs)为试验对照组,以感染率、抑制率、转阴率、复燃率、存活率为评价指标,通过皮尔逊四天抑制法考察ADLs的体内抗疟活性。5.胆碱衍生物修饰的蒿醚林酸复合物脂质体的体内外抗肿瘤活性研究通过MTT法评估ADLs对小鼠乳腺癌4T1细胞的抑制作用;用悬浮的4T1细胞皮下接种Balb/C小鼠乳房,建立Balb/C荷瘤小鼠模型。以肿瘤生长体积、小鼠体重、抑瘤率及生存曲线等为评价指标,通过连续四次隔天给药法,考察ADLs的体内抗肿瘤活性。结果:1.胆碱衍生物修饰的蒿醚林酸复合物的合成及表征FT-ICR MS测得的精确质量数和理论值的相对误差均在±3 ppm之内,~1H-NMR和~(13)C-NMR的图谱结果与对应化合物的结构相一致,表明成功合成AD。其中,季铵化反应生成CD产率为65.65%,AA产率为31.71%,过量的胆碱衍生物与AA发生酯化反应生成的AD产率为63.31%。2.胆碱衍生物修饰的蒿醚林酸复合物脂质体的制备及处方优化建立了HPLC法用于AD的含量测定及其制剂的体外分析,经过分析方法的验证,在2~1200μg/ml的浓度范围内,AD的线性关系良好;AD定量限为1.5μg/ml,检测限为1.0μg/ml;方法的精密度、回收率均符合方法学要求。通过单因素法确定了最佳脂质体处方为:药脂比1:10,水化温度40℃,胆固醇与磷脂之比1:25。在该处方下,ADLs外观透亮,透射电镜下显示该脂质体呈圆形或近圆形;ADLs的平均粒径为(164.4±1.8)nm,Zeta电位为(40.87±0.86)mV;超滤法测得包封率为(95.74±0.10)%,计算得载药量为(12.60±0.05)%;ADLs的体外释放行为显示,脂质体具有较好的缓释特征,在12 h内释放量达48.93%,无明显突释现象。3.胆碱衍生物修饰的蒿醚林酸复合物纳米脂质体在大鼠体内的药动学研究所建立的HPLC-MS/MS法符合方法学要求,可用于测定大鼠血浆中AD和AA的含量。药动学结果显示,ADLs的AUC,t_(1/2),CLz,Vz分别是AD-SOL的4.54、2.09、0.23、0.55倍,AALs的AUC,t_(1/2),CLz,Vz分别是AA-SOL的2.57,1.94,0.38,0.68,这个结果说明,纳米脂质体相比溶液剂可以增加药物的AUC、延长生物半衰期、减少清除率和表观分布容积;相比AA的溶液剂和脂质体组,AD的溶液剂和脂质体组的AUC和t_(1/2)都显著增加,CLz和Vz显著减少。4.胆碱衍生物修饰的蒿醚林酸复合物纳米脂质体的体内抗疟药效学研究空白脂质体组、溶剂组、感染不治疗组对疟原虫的感染率无统计学差异(P0.05),说明空白脂质体组和溶剂组对疟原虫无抑制作用。各制剂组的感染率、抑制率、转阴率、复燃率、存活率、ED_(50)和ED_(90)结果表明,各制剂组的抗疟顺序为ADLsDHALsAALsAALs-CDLsCDLs。5.胆碱衍生物修饰的蒿醚林酸复合物纳米脂质体的体内外抗肿瘤活性研究MTT试验显示,ADLs对小鼠乳腺癌细胞(4T1)的细胞毒性呈时间和浓度依赖关系,顺序依次为:DHA-SOLADLsAA-SOL生理盐水组;体内抗肿瘤活性结果表明各组抑制肿瘤生长顺序依次为:ADLsDHA-SOLAA-SOL生理盐水组。结论:1.成功合成胆碱衍生物修饰的蒿醚林酸复合物,并用FT-ICR MS、~1H-NMR和~(13)C-NMR确证了其结构。2.采用单因素优化后的处方制备ADLs,该脂质体的形态、粒径及其分布、EE、DL、稳定性和释放度等指标都符合预期的要求。3.药动学试验表明,将AD和AA制备成脂质体,或是将AA键合胆碱衍生物后,都可以显著优化药代动力学参数,包括延长生物消除半衰期,降低血液中的消除等。4.体内抗疟药效学试验表明,ADLs的抗疟作用具有浓度依赖性,其抗疟效果优于DHALS,AALS,AALS-CDLS和CDLS,且小鼠存活率最高。5.MTT试验表明AA-SOL组,ADLs组和DHA-SOL组对4T1细胞的抑制率具有时间和浓度依赖性,其中,ADLs对4T1细胞的细胞毒性大于AA-SOL;体内抗肿瘤药效学结果表明,与AA-SOL和DHA-SOL相比,ADLs在小鼠体内的抗乳腺癌效果明显,能明显抑制肿瘤的体积和瘤重,提高小鼠的存活率。
【学位授予单位】:山西医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R96

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