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基于miRNA标记外周血与月经血鉴别方法的研究

何红霞  
【摘要】:目的:血液作为法医学最常见的体液检材,其准确定性意义重大,而对确定为血液的样本进一步鉴别其是外周血还是月经血,更是可为案件定性提供重要的指向性线索。本研究根据两种血液类体液(外周血和月经血)和三种非血液类体液(唾液、精液、阴道分泌液)中多种miRNA差异表达的特征,构建可区分血液与非血液类样本和区分外周血与月经血法样本的数学模型,以实现外周血与月经血的准确鉴别,同时为解决法医学体液鉴别难题提供高度可行的参考方案。方法:1.本研究从文献中挑选出在血液与非血液类样本中差异表达的miR-451a及在外周血与月经血中差异表达的三种miRNA(miR-205-5p,miR-214-3p,miR-203-3p),收集200份五种法医学常见体液样本(外周血、月经血、唾液、精液、阴道分泌液),分为训练集和验证集样本,采用SYBR Green荧光实时定量PCR技术检测包括内参基因RNU6b在内的五种标记,采用SPSS 22.0软件对训练集样本的检测结果进行差异性分析并建立包括两个判别函数在内的Fisher判别分析模型,第一个判别函数以“血液类样本”和“非血液类样本”为因变量,miR-451a的检测结果ΔCt值为自变量,第二个判别函数以“外周血”与“月经血”为因变量,三种miRNA(miR-205-5p,miR-214-3p,miR-203-3p)的检测结果ΔCt值为自变量,逐步实现血液与非血液类样本的鉴别和外周血与月经血法样本的鉴别,验证集样本被用于检验该模型的准确度。2.在前期研究基础上,我们继续收集法医学五种体液样本250份,增添两种miRNA(miR-144-3p,miR-144-5p),以“外周血”、“月经血”、“非血液类体液(唾液、精液、阴道分泌液)”三种体液为因变量,训练集样本的六种miRNA的检测结果ΔCt值为自变量,构建可同时实现血液与非血液类样本的鉴别和外周血与月经血样本的鉴别的Fisher判别分析模型,验证集样本被用于检验该模型的准确度。3.为了比较两种外周血与月经血判别分析模型,并验证本研究基于单一体液来源的样本构建的判别分析模型是否适用于混合样本的鉴别,我们随机选取8份外周血样本及8份月经血样本,同时制备外周血与月经血混合样本,检测六种miRNA(miR-451a,miR-144-3p,miR-144-5p,miR-205-5p,miR-214-3p,miR-203-3p)的表达量,将结果ΔCt值代入两种判别分析模型中比较两种判别分析模型鉴别外周血与月经血单一样本及混合样本的准确性。结果:本研究成功构建可既区分血液与非血液类样本又可以区分外周血与月经血样本的两种判别分析统计模型,第一种判别分析模型(逐步法):模型自身验证准确率达100%,交叉验证准确率达100%,模型经验证集样本验证准确率达100%,所构建两种判别分析模型鉴别单一体液来源的样本均具有高度的准确性;第二种判别分析模型(非逐步法):模型自身验证准确率达99.5%,交叉验证准确率达99.5%,模型经验证集样本验证准确率达100%;另外,两种判别分析模型比较实验结果显示:外周血和月经血两种体液的单一体液来源样本均被正确鉴别,但是混合样本鉴别结果与理论结果存在差异,目前所构建模型仅适合于单一体液来源样本的鉴别。结论:本研究所构建的两种外周血与月经血判别分析模型均具有高度的准确性,可以根据检材量,进行方法选择,或同时使用相互印证。本研究为血液与非血液类样本的鉴别、外周血与月经血样本的鉴别提供了科学的鉴别策略,有望在法医学实践中进行应用。


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