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成年大鼠海马CA1区锥体神经元外向整流氯离子单通道特性及脑缺血后通道活动持续性增强

李建国  
【摘要】:第一部分:成年大鼠海马CA1区锥体神经元外向整流氯离子单通道特性 Cl~-是生物体内含量最多的阴离子,氯通道参与了跨细胞膜和细胞器膜Cl~-的转运。氯通道种类众多,分布广泛,参与了细胞多项生理功能的调控,如调节细胞兴奋性、跨上皮细胞膜物质转运、细胞容积和细胞内pH调控等。目前有三类已知基因并克隆表达的氯离子通道:ClC氯通道(ClC-1~ClC-7,ClC-K1和ClC-K2)、配体门控氯通道(GABA和甘氨酸受体)和囊性纤维变性调节因子氯通道(CFTR)。外向整流氯离了通道(outwardly rectifying chloride channels,ORCC)是一类中电导氯通道,分子结构目前仍然不清楚,但是其广泛分布于上皮细胞、神经胶质细胞、成纤维细胞、淋巴细胞、心肌细胞等多种组织细胞。在神经系统,Strupp等人发现在人和大鼠的神经轴突有外向整流特性的氯通道,Lascola发现新生大鼠皮层胶质细胞存在ORCC。近来研究发现:ClC-3作为ORCC的候选基因,大量分布于海马区、嗅球和小脑。但是,对成年大鼠中枢神经系统ORCC,目前尚无研究。 除了磷酸化作用,氧化还原亦参与通道功能的调控过程。在某些病理情况下,如可引起成年大鼠海马CA1区锥体神经元出现凋亡的短暂性前脑缺血,神经元内的氧化还原状态会发生明显改变,并影响通道的功能活动。要阐明氯通道在缺血后海马CA1锥体神经元凋亡中的作用,有必要首先对这些神经元的外向整流氯离子通道有较清楚的认识。为此,本文观察了在成年大鼠海马CA1区锥体神经元上是否有外向整流氯离子通道,并对其单通道特性进行了系统的研究。 1 材料和方法 山西医科大学20仍博士学位论文 1.!脑片的制备与神经元的急性分离 按我们以往报道的方法进行神经细胞的急性分离。实验采用成年雄 性wistar大鼠(1 80一2509),麻醉后(水合氯醛40 mg八009)迅速断头取 脑,用振动切片机切成400林m厚的脑片。将切好的脑片置于通以95% ()z巧%CO:混合气的EBSS液中孵育l一6小时,然后分离海一马C八!区 红l织井放入少}J 100%O:饱和的HBsS液中片J链已l蛋户I酶(protease xlV, !.!一1.4 mg/ml)消化30一45分钟,控制温度为33℃,置于低ca2+的羚 乙基磺酸钠缓冲液中吹打成细胞悬液备用,实验选用形态饱满的锥形或 梭形、有顶树突和基树突特征的锥体细胞进行记录。 2单通道电流记录与数据分析 公巧验采川I勺I{川;.j外J弋)I莫)llt乍1讨支术,l匕极中jl‘}!.为8一12M‘2‘,’}‘,.通j返 电流经)J莫片钳放大器(Axopateh ZooB)由A/o转换系统(oigidata 1 320)以 5 kHz频率采集,低通滤波为1 kHz。数据采集、分析使用pClamp 8.0、 SpSS 1 0.0和Origin7.0软件。测量通道开关事件的时间分辨率为300卜s, 通道的开放概率指通道总开放时间占总记录时间的百分比。单通道的电 流一电压关系曲线由二次方程式拟和,单通道电导由一定范围内做线性 回归得到。实验记录时环境温度为20一22℃。 1.3溶液和试剂 轻乙基磺酸钠缓冲液成份为(mmol/L):轻乙基磺酸钠140,KC12, MgC124,CaC12 0.1,glueose 23,HEpES 15,用IN NaOH将pH值调定为 7.35。浴槽液和电极内液成份为(mmol/L):NaCI 150,eael:2,HEPEs 10, pH 7.4,在部分实验中选用葡萄糖酸钠替代NaCI来改变细胞膜两侧CI- 浓度。DIDS、SITS、NPPB、优降糖、niflumie aeid、DTNB、DTT、GSSG、 GSH、链霉蛋白酶、HEPES、EBSS、HBSS、经乙基磺酸钠均为Sigma (关lt{I))叙:W.,其它为国产分析纯试剂。 1.4统计学处理 全部数据以平均数士标准误(means士S.E.M)表示,统计分析采用t 山西医科大学 2003博士学位论文 检验和ANOVA方差分析,p0.05认为有显著性差异。 2结果 2.1单通道电流记录 在对称Cl’浓度(!50八50mmol几)的情况卜,采用)JR片钳内向向外 式记求技术,在32%(134/4 15)的游离膜片,},记求到外向整流抓离r通 道。单通道主要由长时间去极化激活,也有少数为自动激活。本实验使 用阶跃电压刺激程序与Tabch盯ani等人基本相同。在形成游离膜片后, 维持膜电位在一30 mV并持续2分钟,如果有单通道电流活动则认为是自 动激活,本实验只记录到7例。否则,将膜电位去极化到十60 mV并持 续3分钟;如果仍无电流活动,则采取以卜步骤激活通道:改变钳制电 位从一6OmV阶跃到+60 mV(每次巧秒,共4次),或从一90 mV阶跃到 到+90 mV,或从一1 20 mV阶跃到+1 20 mV。仍然没有单通道活动的膜片 则认为不含有外向整流氯离子通道。 图1为外向整流氯离子单通道电流图及其电流一电压关系曲线,从 图中可以看出通道具有外向整流特性。在一60~0 mV范围(内向电流) 的单通道电导为18.23士0.96 ps;而在O一十6omV范围(外向电流)的 电导为42.26土1 .20 ps(n一20)。通道多呈一级开放,并且很少有其它类 型通道电流的活动。 2.2通道的离子选择性分析 图2为Cl一被葡萄糖酸部分替代前后单通道电流的变化。在对称Cl- 浓度(150/150mmol/L)情况下,翻转电位为一4.17士l.84mV(n二20,图 ZC)。当浴槽液(细胞内侧)CI.浓度下降到30 mmol几后,电流一电压 关系曲线向左移动,翻转电位变为一34.23士4.86 mV(n=5,图ZA,C):


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