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《山西医科大学》 2004年
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溶血磷脂酸影响胚胎神经干细胞增殖和分化的初步观察

崔慧林  
【摘要】:神经干细胞(neural stem cells,NSCs)广泛存在于胚胎脑组织中,也存在于成年哺乳动物的神经系统。NSCs具有自我更新能力,能够定向分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。NSCs的这一特点使其有望成为体外移植治疗神经系统损伤和退行性疾病的重要材料。 溶血磷脂酸(lysophospatidic acid,LPA)是一种简单的磷脂类物质,是血清的正常成份,而且正常情况下也存在于脑组织内。LPA的受体,LP_(Al-3),在多种细胞的细胞膜上有不同表达。LPA与G蛋白耦联的受体结合后,激活下游信号传导通路,从而调节体内各种细胞,包括神经元、神经胶质细胞等的功能活动。LPA在细胞水平的作用很广泛,主要是影响细胞形态,促进细胞增殖和存活,诱导细胞凋亡,改变离子电流和钙胞内释放等。Contos等曾报道,1.0 μmo/L LPA可以促进小鼠胚胎NSCs的增殖。但也有文献报道LPA的作用具有两面性,即不同浓度的LPA对同一细胞的功能影响不同;而且,LPA对来自大鼠胚胎的NSCs的增殖和分化方面的影响如何,并未见有关报道。因此,本实验第一部分探讨了LPA对体外培养的NSCs的增嫩的影响,并对其信号转导途径作了初步分析。在证实一定浓度的LPA对NSCs的促增殖作用后,在第二部分我们又观察了LPA对血清诱导的NSCs向神经元、特别是胆碱能神经元分化的影响,同时也观察了LPA对细胞早期迁移过程的影响。因为NSCs在血清诱导下也向神经胶质细胞分化,而且神经胶质细胞在神经系统的功能越来越受到重视, 山西医科大学博士学位论文 所以在第三部分我们观察厂LPA对N SC引句少突胶质细胞和星jFj)坟质细胞 分化的影响。 第一部分LPA对NSCs的增殖的双重作用和它的促增殖作用的 信号转导途径的初步分析 取自孕14天的大鼠胚胎大脑皮层组织的神经干细胞,经体外分离和纯 化后,用其第三代(20 DIV)作进一步研究。生长培养液中生成的神经干 细胞球,经机械分离成单个的NSCs,重新悬于生长培养液中,分别加入 不同浓度的L队(0 .01一10林mol/L),于第7天计数生成的神经球数,分 析LPA对NSCs增殖的影响;为进一步验证LPA对NSCs增殖的影响,经 机械分离成单个的NSCs,重新悬于不含生长因子的培养液中 24h,使其 进入G()期,然后加入‘}:.长因犷和不同浓度的LpA培养3天,在最后24h 加入【,H】胸腺IJ密l定,观察不同浓度L队对口H]胸腺11密咤摄入的影响。为了 分析L队作用的信号转导途径,在加入L队的同时还加入了百日咳毒素 (pertussis toxin,pTx),用以上两种方法观察pTX对LpA作用的影响;此 外还进一步用RT一PCR法分析了己知的三种LPA受体在NSCs的表达情况。 结果显示:(1)神经球计数和口H〕胸腺嗜睫掺入法都显示不同浓度的LPA 对NSCs的增殖作用有双面性,即低浓度LPA(毛1 .0林mol几)对NSCs的 促增殖作用呈剂量依赖性递增,且在1.0卜mol几时达高峰,分别是对照组 的1.69士0.15倍和!.50士025倍,以后增娘的程度随浓度的增加而逐渐减弱, 当L队的浓度达到或高于3.0林mol几时,和对照组相比NSCs不再明显增 殖,甚至随浓度增力}_}而递减;(2)为了分析可能的信号转导途径,我们在 加入1.0林,们01/L LPA的l、‘J!{、J加入PTX(一00 ng/!二一),神经球计数矛l![’H]){匈 山西医科大学博士学位论文 腺嗜陡掺入法显示LPA引起的NSCs的增殖分别被抑制了98%和89%。 (3)RT一PCR技术检测结果显示,LPAI受体和LPA3受体的mRNA在NSCS 的表达很显著,而LPAZ受体mRNA的表达非常微弱。以上结果显示,L队 对NSCs的增殖呈双重作用,起促增殖作用的最佳浓度在1.0林mol几左右, 而推测它的促增殖作用可能主要通过与NSCs表面LPA,和LPA3受体祸联 的PTX敏感性Gi一Ras一Raf-MAPK信号转导途径实现的。 第二部分:LPA对NSCs向MAPZ阳性和ChAT阳性神经元分化以 及细胞迁移的促进作用 由于1.0一3.0林mol几范围内的LpA对NSCs的增殖有不同程度的促进 作用,我们进一步用这个浓度范围LPA来观察它对血清诱导的NSCs向神 经元分化的影响。我们分别选择了MAPZ(mierotubule一assoeiated protein一2) 标记一般神经元和ChAT(choline aeetyltranferase)标记胆碱能神经元,观 察LPA对这两种神经元的生成影响。我们用免疫细胞化学荧光双标技术研 究这两种神经元,同时用核染料Hoechst 33342标记培养物中所有的细胞 核,检测和计算不同浓度L队对M妙2阳性细胞和M妙2、ChAT均阳性 细胞(即ChAT阳性神经元)的出现时间和数量百分比的影响,并进一步 用westem一blot技术检测MAPZ和Ch户J,蛋白的表达变化。结果显示:(1) 加入1.0林mol几LPA后24h,即检测到MAPZ阳性神经元出现,而对照组 和其它浓度LPA实验组均在48h后出现:ChAT阳性神经元在各处理组与 对照组均在第5天才出现;(2)加入不同浓度LPA后7天检测这两种神经 元在培养细胞中的比例,发现MAPZ阳性和ChAT阳性神经元的增加均对 L队的加入呈剂量依赖性,增加高峰时的L队浓度是0.1林mol/L,这时 山西医科大学博士学位论义 MAPZ阳性神经元所占百分比由对照的26%增加到40%,而ChAT阳性神 经元则由7%增加到25%;而
【学位授予单位】:山西医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R338

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