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《山西医科大学》 2009年
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高迁移率族蛋白B1在肝纤维化发生发展中的作用及其机制的研究

韩红莉  
【摘要】: 目的检测肝纤维化大鼠高迁移率族蛋白B1( High mobility group box protein 1,HMGB1)的表达及HMGB1对肝星状细胞(Hepatic stellate cell,HSC)分泌细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)的影响,探讨HMGB1在肝纤维化发生发展中的作用及其机制。 方法本研究包括动物实验和细胞实验两部分: (1)动物实验:Wistar雄性大鼠30只,采用四氯化碳(CCL4)制备大鼠肝纤维化模型。随机分为五组:正常对照组和四个模型组(CCL4分别作用2W、4W、6W、8W),分别留取各组大鼠血清和肝组织标本。采用全自动生化分析仪和放射免疫法检测血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、透明质酸(HA)的含量;免疫组织化学方法和Image-ProPlus5.0图像分析系统测定肝组织HMGB1的表达水平;HE染色观察肝组织标本病理改变。 (2)细胞实验:1、肝星状细胞(Hepatic stellate cell ,HSC)的培养:HSC-T6细胞复苏后,DMEM培养液37℃5% CO_2孵箱中培养,待铺满80%后0.25%胰酶、0.02% EDTA消化,传代3~4次至对数生长期用于实验。调整细胞浓度为2-5×10~5 ,转至6孔细胞培养板,每孔1ml培养液,继续培养24h,细胞单层融合达80%后,换无血清的DMEM培养液孵育2h,使培养细胞均处于G0期用于实验。2、分六组观察不同浓度的HMGB1刺激HSC-T6细胞对ECM合成分泌的影响:HMGB1 0 mg/L、0.1mg/L、1.0mg/L、10mg/L、20mg/L和40mg/L组,每组3个复孔,作用6h后,分别收取细胞培养液, 1000r/min 20min离心,收集培养上清液用双抗体夹心ELISA检测Ⅲ型前胶原(PⅢP);Ⅳ型胶原(CⅣ)的含量。3、分两组观察HMGB1刺激HSC-T6细胞分泌ECM的时间效应:对照组和HMGB1刺激组(10mg/l HMGB1) ,每组分别于0h、6h、12h、18h、24h五个时间点(每个时间点3个复孔)收取细胞培养液, 1000r/min 20min离心,收集培养上清液,用双抗体夹心ELISA方法检测PⅢP ,CⅣ的含量。 结果 1.肝组织病理学改变:正常组肝细胞排列规则, HMGB1的表达仅在细胞核内可见。模型组在2周、4周、6周时,胶原纤维增生逐渐明显直至第8周出现大小不等的假小叶,形成肝硬化,并且在肝纤维化的增生过程中始终不同程度地伴有炎细胞浸润。 2.血清ALT、HA及肝组织中HMGB1水平:模型组第2周、4周、6周、8周ALT值分别为:229.82±17.680U/L、115.68±15.145U/L、103.94±20.639U/L和72.15±30.78U/L,均明显高于正常对照组42.85±19.919U/L(P0.05);模型组第2周、4周、6周和8周HA值分别为916.12±215.84 ng/ml、1330.28±169.01 ng/ml、488.01±266.40 ng/ml和205.58±41.50 ng/ml,均明显高于正常对照组107.86±74.74 ng/ml(P0.05 );模型组第2周、4周、6周、8周HMGB1 IOD值分别为1364.3±216.4、821.1±151.5、802.4±102.3和437.7±128.6均明显高于正常对照组57.1±43.2 (P0.05 ),ALT及HMGB1值第2周达峰值,HA第4周达峰值。 3. HSC-T6细胞分泌ECM的剂量效应:HMGB1能促进HSC-T6分泌PIIIP、CIV,在一定浓度范围内(0.1~10mg/L)呈剂量依赖关系(r_1=0.835、r_2=0.955,P_1=0.0014、P_2=0.0030)。当HMGB1浓度为10 mg/L时,HMGB1显著促进HSC-T6分泌PIIIP、CIV,达峰值;当HMGB1浓度为20 mg/L时,HSC-T6 PIIIP、CIV的分泌量与HMGB1浓度10 mg/L时相当;HMGB1浓度为40 mg/L时,HSC-T6 PIIIP、CIV的分泌量下降。 4. HSC-T6细胞分泌ECM的时间效应:HMGB1刺激组HSC-T6分泌PIIIP、CIV的量在0~24h间呈递增趋势呈时间依赖关系(r_1=0.970、r_2=0.966,P_1=0.0061、P_2=0.0076),正常对照组上清液PIIIP、CIV含量变化趋势同HMGB1刺激组。HMGB1刺激组HSC-T6分泌PIIIP、CIV的量在各时间点高于对照组,在6h和12h两个时间点两组间无显著差异(t_1=2.093、t_2=0.965、t_3=0.642、t_4=0.751,P_1=0.12、P_2=0.31、P_3=0.50、P_4=0.46),但在18h、24h两个时间点刺激组上清液PIIIP,CIV含量明显高于正常对照组(t_1=7.923、t_2=2.138、t_3=6.306、t_4=7.925,P_1=0.0005、P_2 =0.04、P_3=0.0002、P_4=0.0006)。 结论 (1)HMGB1在肝纤维化形成过程中表达增加,并且肝组织中HMGB1的表达水平与炎症的严重程度及纤维化的形成具有一致性。 (2)HMGB1促进HSC-T6 ECM分泌呈时间和剂量依赖关系,HMGB1是维持HSC-T6 ECM持续分泌的重要因素,在肝纤维化的发生发展中发挥重要作用。 (3)HMGB1对HSC-T6的持续激活对肝纤维化发生发展机制的研究具有重要意义。
【学位授予单位】:山西医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R575.2

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