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ERK活性对哮喘大鼠CyclinD1表达的影响及调控作用

张爱芝  
【摘要】: 目的:探讨细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)对哮喘大鼠气道CyclinD1表达的影响,ERK在调控大鼠气道平滑肌细胞增殖中CyclinD1的作用。 方法:本研究分两部分 第一部分:原代培养大鼠的平滑肌细胞(ASMCs),给予ERK激动剂表皮生长因子EGF和抑制剂PD98059干预ASMCs生长,依处理方式不同分为5组:(1)正常对照组;(2)哮喘对照组;(3)E组:EGF20ng/mL; (4) P+E组:PD98059 10μmol/L 1个小时后添加EGF20ng/ml; (5)PD组:PD98059 10μmol/L。采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测气道平滑肌细胞(ASMCs)增殖能力,流式细胞术(FCM)测定细胞周期和CyclinD1的蛋白含量,RT-PCR方法检测CyclinD1 mRNA表达水平。 第二部分:原代培养气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells,ASMCs),采用正常和哮喘大鼠的第3-6代细胞,分别给予ERK激动剂表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)和抑制剂PD98059干预ASMCs生长,根据处理方式不同分别分为4组:(1)空白组;(2)E组,EGF20ng/mL;(3)P+E组,PD98059 10μmol/L+EGF 20ng/ml; (4)PD组,PD98059 10μmol/L。采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测气道平滑肌细胞(ASMCs)增殖能力,流式细胞术(FCM)测定细胞周期,RT-PCR方法检测ERK1/2和CyclinD1 mRNA表达水平,线性相关分析评价ERK和CyclinD1表达的关系。 结果: 第一部分: (1)在E组、PD组与哮喘(正常)对照组比较,其S+G2/M期比例和吸光度A值差异有统计学意义(P0.05);P+E组与对哮喘对照组比较差异无统计学意义。 (2)E组、PD组的CyclinD1蛋白和CyclinD1 mRNA的表达水平与哮喘(正常)对照组比较,差异有统计学意义(P0.05);而P+E组与哮喘空白组比较无明显差异(P0.05);在本实验中CyclinD1蛋白和CyclinD1 mRNA的表达趋势一致。 第二部分: (1)在哮喘组内,E组、PD组与哮喘空白组比较,其S+G2/M期比例和吸光度A值差异有统计学意义(P0.05);在正常组组内,E组、PD组与正常空白组比较,其S+G2/M期比例和吸光度A值差异有统计学意义(P0.05);哮喘组的S+G2/M期比例和吸光度A值比正常组要高。 (2)在哮喘组内,E组、PD组的ERK1/2 mRNA和CyclinD1 mRNA的表达水平与哮喘空白组比较,差异有统计学意义P0.05);正常组组内与哮喘组组内变化趋势一致,哮喘组的ERK1/2 mRNA和CyclinD1 mRNA的表达比正常组高。 (3)在mRNA水平,对大鼠ASMCs ERK1/2和CyclinD1的表达采用相关分析,结果显示ERK1/2和CyclinD1的表达呈明显正相关(r=0.565,P0.01)。 结论: (1)ERK活性促进哮喘大鼠ASMCs的增殖,同时使CyclinD1在哮喘平滑肌细胞中的表达增加,提示ERK活性的改变直接影响了CyclinD1在大鼠气道的表达,进而影响气道重塑的形成,为阐明哮喘的发病机制提供实验依据。 (2)ERK能促进正常大鼠和哮喘大鼠ASMCs增殖,CyclinD1参与了正常和哮喘大鼠ASMCs的增殖,ERK1/2和CyclinD1的相关性分析提示ERK信号通路可能通过调节CyclinD1表达进而影响大鼠ASMCs的增殖。


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