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《山西医科大学》 2010年
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重组人核心蛋白聚糖对白血病K562细胞体外影响的实验研究

景刚  
【摘要】: 目的:观察重组人核心蛋白聚糖(rhDCN)对白血病K562细胞生长抑制、凋亡的影响,并探讨可能的作用机制。 方法:1.将已构建好的pcDNA3.1(+)-DCN真核表达载体经EcoRI、NotI双酶切、测序鉴定。2.鉴定正确的重组质粒大量纯化扩增后,通过LipofectamineTM2000脂质体介导转染对数生长期的白血病K562细胞,提取转染后48h细胞的总RNA,并进行RT-PCR鉴定。3.试验分为0.9% NaCl溶液组、pcDNA3.1(+)/K562组、pcDNA3.1(+)-DCN/K562组和脂质体组。4.经瑞特染色观察转染后细胞形态的改变,MTT法检测细胞增殖活性,碘化丙啶(PI)染色,流式细胞术分析细胞周期及凋亡。5.Western blot检测细胞凋亡相关蛋白BCL-XL、Mcl-l及Bax的表达。 结果: 1.重组质粒双酶切后,所得基因片断与预期基因片断大小相符;测序结果与Genebank中的DCN基因序列完全相符,无突变。 2.通过脂质体转染法将pcDNA3.1(+)-DCN重组质粒转入K562细胞后,RT-PCR结果证实转染成功。 3.pcDNA3.1 (+)-DCN/K562组瑞特染色呈现典型的凋亡形态学改变,其他各组无明显凋亡形态学改变。 4.MTT结果显示,pcDNA3.1 (+)-DCN/K562组细胞增殖抑制率(转染24h为16±1.08%,转染48h为14±1.01%,转染72h为20±1.19%)明显高于对应时间点其他组增殖抑制率,差别有统计学意义(P0.05);FCM检测结果显示,pcDNA3.1 (+)-DCN/K562组凋亡率(20.15±1.31%)、细胞的G0/G1期细胞百分率(51.15±0.57%)与其他各组结果比较增加明显,差别有统计学意义(P0.05)。 5.Western blot结果显示pcDNA3.1 (+)-DCN/K562组与其他各组比较BCL-XL、Mcl-1蛋白表达减低,Bax蛋白表达升高。 结论:rhDCN重组质粒可有效抑制K562细胞增殖,并诱导其凋亡。rhDCN对细胞周期及凋亡相关蛋白BCL-XL、Mcl-1、Bax的影响可能是其发挥作用的机制,为白血病生物治疗提供了新的实验依据。 目的:研究重组人核心蛋白聚糖(rhDCN)联合多柔比星(ADM)对白血病K562细胞生长的影响,并分析其可能机制。 方法:用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液体外培养K562细胞,经脂质体介导转染对数生长期的K562细胞,试验分为0.9% NaCl溶液组、pcDNA3.1(+)-DCN/K562组、ADM/K562组、pcDNA3.1(+)-DCN加ADM/K562组。瑞特染色观察细胞形态学改变;采用MTT法检测细胞增殖活性;流式细胞术(FCM) Annexinv/PI双染色,分析细胞凋亡;采用RT-PCR法分析各处理组K562细胞TGF-β1mRNA水平表达的变化。 结果:pcDNA3.1(+)-DCN加ADM/K562组细胞比单独DCN和ADM组细胞,染色呈现更显著的凋亡形态学改变;MTT结果显示联合组细胞增殖抑制率(61±1.32%)明显高于单独干预组(DCN组20±1.9%;ADM组47±1.04%)(P0.05),FCM检测结果显示联合组细胞凋亡率(61.30±0.9%)与单独干预组(DCN组28.25±1.3%;ADM组31.85±1.5%)比较增加明显(P0.05),RT-PCR结果显示联合组细胞TGF-β1 mRNA的转录减少。 结论:rhDCN可以明显增强ADM对K562细胞的杀伤作用,提高肿瘤细胞的凋亡率。对TGF-β1 mRNA转录的影响可能是发挥协同效应的原因,其具体机制有待进一步研究。
【学位授予单位】:山西医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R733.7

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