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《山西医科大学》 2010年
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重组人生长激素和骨髓干细胞移植联合治疗阿霉素性心肌病心力衰竭的实验研究

姚巍  
【摘要】: 目的: 骨髓干细胞是具有自我复制和多向分化潜能的多能干细胞,可修复损伤的心肌细胞和血管内皮细胞。目前骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)和骨髓动员出CD34+单个核细胞(CD34+mononuclear Cell CD34+MNC)在扩张型心肌病(DCM)中的研究仍处于起步阶段,尚缺乏理论证据。本研究分为两部分,为重组人生长激素(rhGH)联合MSCs静脉移植对阿霉素性心肌病心力衰竭大鼠的治疗研究和rhGH联合骨髓动员对阿霉素性心肌病心力衰竭大鼠的治疗研究。首先确定MSCs和CD34+MNC是否归巢到心脏受损部位,探讨重组人生长激素(recombinant human growth hormone, rhGH)对MSCs和CD34+MNC的存活和分化的影响,从心功能和心室重塑两方面观察其疗效,并推测其可能的机制,试图寻找一种干细胞移植更为简便有效的方法,为临床治疗扩张性心肌病所致心力衰竭提供理论依据。 方法: 1.阿霉素性心肌病心力衰竭大鼠模型的选择 通过腹腔注射阿霉素的方法制作阿霉素性心肌病心力衰竭大鼠模型。模型1组采用2.5 mg/kg、3次/周、用2周、共计6次,总剂量15 mg/kg。末次注射完成后观察2周。模型2组采用2.5 mg/kg、1次/周、用6周、共计6次、总剂量15 mg/kg。末次注射完成后观察2周。通过心脏彩色多普勒超声和血液动力学检测评价其心功能指标。留取心脏标本,测定体重、心脏重量和左心室重量,并观察心腔大小。留取左心室和肝、肾标本用HE和电镜观察病理变化,确定最佳制作模型。 2.间充质干细胞(MSCs)的体外分离、培养、鉴定、标记和心脏归巢 选体重约100g左右、5周龄的Wistar大鼠,提取股骨、胫骨的骨髓,利用MSCs贴壁生长的特点分离和培养骨髓间充质干细胞;观察其形态改变,取3代MSCs通过流式细胞仪测定其表面抗原CD44、CD45和CD34,证实体外培养的细胞为骨髓间充质干细胞。静脉移植前,用5-溴脱氧脲嘧啶(Brdu)标记MSCs并通过Brdu免疫组织化学法检测体外Brdu标记的MSCs在心、肝、肾的分布。 3. rhGH联合MSCs静脉移植在阿霉素性心肌病心力衰竭大鼠中治疗的研究 将实验动物分为心衰组(HF组)30只、MSCs静脉移植治疗组(MSCs组)30只和rhGH+MSCs移植联合治疗组(GH+MSC组)30只。MSCs组和GH+MSCs组动物通过尾静脉注射MSCs(细胞密度为1 X 109个/ml)。GH+MSCs组皮下注射rhGH,2mg/kg、每日1次,连续10天。心衰组动物不作任何处理。治疗前和治疗后4周留取静脉血标本测定内皮素-1(ET-1)和脑利钠肽(BNP)的浓度。同时通过心脏彩色多普勒超声测定LVIDd、LVIDs、LVEF和LVFS;经右颈总动脉插管入左心室,测定LVSP.+dp/dt max、LVEDP及-dp/dt max;留取心脏标本,采用免疫组织化学双染的方法同时检测Brdu(细胞核)和肌球蛋白重链(MHC)(细胞浆)及Brdu(细胞核)和肌动蛋白(Actin)(细胞浆)证实MSCs进入体内分化为心肌细胞,并观察其在心肌内的存活和分布情况。用Brdu免疫组化观察血管内皮细胞形成状况;经HE染色观察血管数目。RT-PCR法测定各组的心肌IGF-1mRNA相对含量。通过VG染色和心肌细胞凋亡指数,观察心室重塑的改善。 4. rhGH联合骨髓动员在阿霉素性心肌病心力衰竭大鼠中治疗的研究 将实验动物分为心衰组(HF组)20只、骨髓动员组(MNC组)30只和GH+骨髓动员组(GH+MNC组)20只。给MNC组和GH+MNC组动物皮下注射rhG-GSF, 50ug/Kg、每日1次、连续5天。心衰组动物给相同剂量生理盐水皮下注射5天。给GH+MNC组皮下注射rh-GH,2mg/kg、每日1次、连续10天。所有大鼠均给予腹腔注射Brdu,连续4周。G-GSF治疗第6天留取静脉血,测定血常规和用流式细胞仪测定CD34,其中10只处死,留取心脏标本测定CD34。治疗前和治疗后4周留取静脉血标本测定ET-1和BNP的浓度;心脏彩色多普勒超声测定LVIDd、LVIDs、LVEF和LVFS;经右颈总动脉插管入左心室,测定LVSP、+dp/dt max、LVEDP及-dp/dt max;留取心脏标本,采用免疫组织化学双染法同时检测Brdu(细胞核)和MHC(细胞浆)及Brdu(细胞核)和Actin(细胞浆)证实MNC进入体内分化为心肌细胞,并观察在心肌内的存活和分布情况。用Brdu免疫组化观察血管内皮细胞形成状况,经HE染色观察血管数目。RT-PCR法测定各组的心肌IGF-1 mRNA相对含量。通过VG染色和心肌细胞凋亡指数,观察心室重塑的改善。 结果: 1.阿霉素性心肌病心力衰竭大鼠模型的选择 模型1组LVIDd和LVIDs较正常组增加(4.11±0.26 mm vs 3.91±0.23mm, P0.05; 2.47±0.31 mm vs 0.97±0.21mm,P0.05);模型2组大鼠的LVIDd和LVIDs较正常组增加(5.55±0.36mm vs 3.91±0.23mm,3.67±0.44mm vs 0.97±0.21mm,P0.05),模型1组和模型2组大鼠的EF和FS均较正常组降低(76.79±8.56%、70.74±7.86%vs 98.51±3.61%;44.52±3.51%、35.11±3.67%vs76.77±1.90%P0.051;LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax均较正常组降低(13.25±0.88 Kpa、12.55±0.78 Kpa vs 16.21±0.24 Kpa; 590.67±73.40 Kpa/s、489.12±53.4 Kpa/s vs 861.67±39.96 Kpa/s; 534.00±59.22 Kpa/s、499±45.22 Kpa/s vs 632.00±45.19 Kpa/s, P0.05), LVEDP较正常组升高(0.97±0.13 Kpa.2.20±0.40vs-0.08±0.17 Kpa,P0.05);体重(BW)较正常组减轻(200.33±8.43g.218.11±8.64g vs 240.33±7.11g,P0.05),HW/BW和LW/BW较正常组增加(3.68±0.29g/kg、3.70±0.22 g/kg vs 2.73±0.44 g/kg;2.84±0.18 g/kg.2.92±0.22g/kg vs2.15±0.10g/kg,P0.05);大体标本显示模型组的心腔扩大,室壁组变薄;心肌HE染色显示模型组大鼠心肌细胞不同程度的变性,模型1组可见坏死。模型1组肝、肾损害较模型2组重。综上述情况模型2组适合研究使用。 2.间充质干细胞(MSCs)的体外分离、培养、鉴定、标记和心脏归巢 体外培养的MSCs呈贴壁生长,大多数细胞为梭形细胞;细胞表面抗原CD45.CD34呈阴性表达,CD44呈阳性表达。MSCs组心肌HE染色可见类似单个核细胞的细胞,Brdu免疫组化染色可见棕色核,而心衰组缺如;MSCs组肝、肾Brdu免疫组化染色未见棕色核。本实验证实体外培养的细胞是MSCs,主要归巢到心脏损伤部位。 3.rhGH联合MSCs静脉移植在阿霉素性心肌病心力衰竭模型中治疗研究 3.1心脏超声心功能测定 MSCs组和GH+MSCs组与心衰组比较,LVIDd,LVIDs均明显降低(3.41±0.72 mm、2.50土0.44 mm vs 5.50土0.34 mm;1.51土0.32mm、1.06±0.33 mm vs3.61±0.56 P0.001);EF,FS均明显升高(89.11±7.58%、93.12±6.44%vs 71.13±8.48%;54.32±2.89%、61.77±3.12%vs35.44±1.91 P0.001)。本实验从超声上证实MSCs静脉移植及加用GH都能明显改善心功能。 3.2血液动力学 MSCs组和GH+MSCs组的LVSP.+dp/dpmax和-dp/dpmax与心衰组比较,均升高(14.88±0.78 Kpa.15.66±0.21 Kpa vs 12.55±0.88 Kpa;790.67±73.88 Kpa/s.827.67±33.96 Kpa/s vs 489.12±53.40 Kpa/s;600.33±45.11 Kpa/s.611.00±43.19 Kpa/s vs 499±45.22 Kpa/s, P0.05);MSCs组和GH+MSCs组的LVEDP与心衰组比较均明显降低(-0.01±0.11 Kpa、-0.03±0.13 Kpa vs 2.20±0.40 Kpa/s,均P0.05)。本实验从血液动力学上证实MSCs静脉移植及加用GH都能明显改善心功能。 3.3 BNP.ET-1 MSCs组和GH+MSCs组的BNP治疗后较治疗前明显降低(210.12土14.44pg/ml vs390.62土11.98 pg/ml;177.34土21.33pg/ml vs401.33土22.12 pg/ml P0.001).心衰组治疗前后BNP水平比较,没有统计学意义(408.25土31.45pg/ml vs388.12土9.52pg/ml p0.05). MSCs组和GH+MSCs组的ET-1治疗后较治疗前明显降低(2.56土0.34 ng/ml vs4.92土0.59 ng/ml;1.88土0.21 ng/ml vs5.01土0.77 ng/ml,P0.001).心衰组治疗前后ET-1水平比较没有统计学意义(5.22±0.30 ng/ml vs 5.12土0.36 ng/ml,p0.05).本实验从血清学指标上证实MSCs静脉移植及加用GH都能明显改善心功能。 3.4心肌切片HE、免疫组化及心肌IGF-1 mRNA相对含量 MSCs组和GH+MSCs组心肌Brdu免疫组织化染色可见血管内皮细胞有棕色核,血管数目明显增多(16.33±1.41/0.2mm、18.44±1.17/0.2mm VS 9.90±1.60/0.2mmP0.001),加用GH后,这种细胞和血管数明显增多。MSCs组和GH+MSCs组心脏免疫组织化学双染可见红色核和棕色胞浆的心肌样细胞,加用GH后,这种细胞明显增多。MSCs组和GH+MSCs组心肌IGF-1 mRNA相对含量较心衰组明显升高(0.7118±0.0106,1.0361±0.0157 vs0.5017±0.0121 P0.05):GH+MSCs组心肌IGF-1 mRNA相对含量较MSCs组明显升高(1.0361±0.0157 vs0.7118±0.0106 P0.05)。本实验证实MSCs在心脏损伤部位可转化心肌样细胞和血管内皮细胞,加GH能增加转换比率;MSCs治疗可提高心肌组织IGF-1 mRNA的相对含量,加GH其含量明显增多,提高MSCs的存活和分化。 3.5 VG染色和凋亡指数 MSCs组和GH+MSCs组与心衰组比较,胶原纤维明显减少,胶原容积分数明显减少(15.20±5.40%、14.33±5.11%vs 19.88±2.78%,P0.05)。MSCs组和GH+MSCs组与心衰组比较能降低凋亡指数(17.44±6.78%、12.34±2.98%vs 27.33±7.98%,P0.05)。本实验证实MSCs静脉移植及加用GH都能降低凋亡心肌细胞数目和胶原纤维,改善心室重塑。 4 rhGH联合骨髓动员在阿霉素性心肌病心力衰竭模型中治疗研究 4.1MNC数目和CD34定性 G-CSF能增加MNC数目,MNC组和GH+MNC组MNC数目治疗后较治疗前明显增高(15.79 X 109/L vs 5.36 X109/L; 15.99 X 109 vs6.30 X 109/L, P<0.05)。心衰组MNC数目治疗前后比较,MNC无差异性(4.92 X 109/L vs 5.39 X 109/L P0.05)。MNC组和GH+MNC组血液中MNC流式细胞仪CD34定性为阳性、心脏免疫荧光CD34定性为阳性;心衰组血液中MNC流式细胞仪CD34定性为阴性、心脏免疫荧光CD34定性为阴性。本实验证实骨髓动员可动员出CD34+MNC并归巢至心脏受损部位。 4.2心脏超声结果 MNC组和GH+MNC组与心衰组比较,LVIDd, LVIDs均明显降低(2.91±0.66mm、2.77±0.77mm vs5.50±0.34 mm;1.51±0.55 mm、1.45±0.26mm vs3.61±0.56 mmP0.001);EF,FS均明显升高(84.55±7.48%、90.24±5.43%vs 71.13±8.48%;46.32±2.89%、54.42±5.12 vs35.44±1.91 P0.001)。本实验从超声上证实骨髓动员及加用GH都能明显改善心功能。 4.3血液动力学结果 MNC组和GH+MNC组的LVSP、+dp/dpmax和-dp/dpmax与心衰组比较,均升高(14.33±0.44 Kpa.15.22±0.33 Kpa vs 12.55±0.88 Kpa;767.44±71.47 Kpa/s.803.67±56.63 Kpa/svs 489.12±53.40 Kpa/s;601.33±42.33Kpa/s.603.00±46.29 Kpa/s vs 499±45.22 Kpa/s, P0.05):LVEDP与心衰组比较均明显降低(-0.08±0.11 Kpa.-0.11±0.17 Kpa vs 2.20±0.40 Kpa/s,均P0.05)。本实验从血液动力学上证实骨髓动员及加用GH都能明显改善心功能。 4.4 BNP、内皮素-1结果 MNC组和GH+MNC组的BNP治疗后较治疗前明显降低(207.55±18.56pg/ml vs377.12±21.38 pg/ml;189.14土27.63pg/ml vs389.43±24.16 pg/ml,P0.001).心衰组治疗前后BNP水平比较没有统计学意义(399.77±21.75pg/ml vs393.12±19.62pg/ml,p0.05).MNC组和GH+MNC组的ET-1治疗后较治疗前明显降低(2.11±0.44 ng/ml vs4.99±0.67 ng/ml;1.89±0.17ng/ml vs5.01±0.87ng/ml,P0.001).心衰组治疗前后ET-1水平比较,没有统计学意义(5.67±0.43ng/ml vs5.70±0.56 ng/ml,p0.05)本实验从血清学指标上证实骨髓动员及加用GH都能明显改善心功能。 4.5心肌切片HE、免疫组化及心肌IGF-1 mRNA相对含量结果: MNC组和GH+MNC组心脏Brdu免疫组织化染色可见血管内皮细胞有棕色核,血管数目明显增多(14.67±1.33/0.2mm.15.65±1.21/0.2mm VS 9.47±1.21/0.2mm,P0.001),加用GH后,这种细胞和血管数明显增多。MNC组和GH+MNC组心脏免疫组织化学双染可见红色核和棕色胞浆的心肌样细胞,加用GH后,这种细胞明显增多。MNC组和GH+MNC组心肌IGF-1 mRNA相对含量较心衰组明显升高(0.7034±0.0113,0.978±0.013 vs 0.497±0.0141P0.05);GH+MNC组心肌IGF-1 mRNA相对含量较MNC组明显升高(0.978±0.013vs0.7034±0.0113 P0.05)。本实验证实MNC在心脏损伤部位可转化心肌样细胞和血管内皮细胞,加GH能增加转换比率;骨髓动员可提高心肌组织IGF-1 mRNA的相对含量,加GH其含量明显增多,提高MNC的存活和分化。 4.6 VG染色和凋亡指数: MNC组和GH+MNC组与心衰组比较,胶原纤维明显减少,胶原容积分数明显减少(13.20±4.40.12.89±4.65 VS 21.21±4.33,P0.05).MNC组和GH+MNC组与心衰组比较,能降低凋亡指数(8.44±6.34%、6..34±5.98%VS 27.33±7.33,P0.05)。本实验证实骨髓动员及加用GH都能降低凋亡心肌细胞数目和胶原纤维,改善心室重塑。 结论: 1.模型2符合治疗研究使用。 2.体外培养的细胞是MSCs,主要归巢到心脏损伤部位,加GH能增加MSCs定居。 3.MSCs在心脏损伤部位可转化心心肌样细胞和血管内皮细胞,加GH能增加转换比率。 4.MSCs治疗可提高心肌组织IGF-1 mRNA的相对含量,加GH其含量明显增多,提高MSCs的存活和分化。 5.MSCs静脉移植及加用GH都能明显改善心功能。 6.MSCs静脉移植及加用GH都能降低凋亡数目和胶原纤维,改善心室重塑。 7.骨髓动员可动员出CD34+MNC,并归巢到心脏损伤部位,加GH能增加CD34+MNC定居。 8.CD34+MNC在心脏损伤部位可转化心肌样细胞和血管内皮细胞,加GH能增加转换比率。 9.骨髓动员治疗可提高心肌组织IGF-1 mRNA的相对含量,加GH其含量明显增多,提高MNC的存活和分化。 10.骨髓动员及加用GH均明显改善心功能。 11.骨髓动员及加用GH均能降低凋亡数目和胶原纤维,改善心室重塑。
【学位授予单位】:山西医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R542.2;R541.6

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