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《内蒙古大学》 2011年
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利用转基因技术创建紫花苜蓿耐盐新种质的研究

张立全  
【摘要】:作物生长、产量和质量受土壤盐渍化限制,已成为世界上的一个普遍问题。紫花苜蓿(Medicago Sativa L.)是一种优良的豆科牧草,蛋白质含量高,维生素和矿物质含量丰富,氨基酸种类齐全,且适口性好,在我国北方地区的农牧业生产和生态建设中发挥极其重要的作用。然而,多数紫花苜蓿品种耐盐能力差,不合适在盐碱地种植。因此,培育合适在盐碱地种植的耐盐丰产的紫花苜蓿新品种,充分利用盐碱地,提高牧草产量,是发展农牧业经济和改善生态环境的有效途径。现代生物技术育种的迅速发展,为培育新的品种提供了高效快捷的方法。 本研究选择紫花苜蓿阿尔冈金品种为材料,通过转基因技术对其进行了耐盐性遗传改良,获得了耐盐性提高的新种质。主要研究结果如下: 1、对紫花苜蓿阿尔冈金品种种子发芽期和苗期的耐盐性分析,结果表明225mmol/L和300 mmol/L的NaCl浓度分别是发芽期和苗期耐盐性筛选的适合浓度。 2、利用花粉管通道法将盐生植物红树(Rhizophora apiculata L.)总DNA导入紫花苜蓿,获得12株耐盐性强的植株。以供体和受体为对照,对12株耐盐植株进行RAPD分析,条带的差异性表现为新增条带、供体特异条带和受体条带丢失。分析引物S178和引物S198在植株Ms-ra3中出现的供体特异条带和新增条带序列,初步证实外源DNA已经整合到受体的基因组中,而且T0代植株耐盐能力提高可能与外源基因的导入有关。移栽T0代耐盐植株至实验地,人工辅助同株自交授粉,获得T,代种子。225 mmol/L NaCl筛选获得T1代幼苗,T1代幼苗经300 mmol/L NaCl胁迫后测定耐盐相关生理生化指标,结果表明T1代植株耐盐性明显增强。T2代幼苗经0.6%NaCl胁迫处理21 d,获得了T2代耐盐株系。 3、比较分析了培养基成分(MS培养基、UM培养基、SH培养基)和激素配比对阿尔冈金品种下胚轴、子叶和子叶节再生的影响,发现子叶节在添加3.0mg/L 6-BA的SH培养基上适宜遗传转化,生根培养时添加0.5mg/L IBA.在此基础上,本研究通过农杆菌介导法首次将盐生植物盐角草(Salicornia europaea L.)Na+/H+逆向运输蛋白基因SeNHXl导入阿尔冈金,PCR检测获得36株T0代转基因植株,移栽温室培养获得6株生长旺盛的植株。RT-PCR检测显示SeNHXl基因在5个转基因植株中获得了表达。0.6% NaCl胁迫表达外源基因的5个转基因植株扦插苗后测定耐盐相关生理生化指标,结果表明这5个转基因植株的多数耐盐相关生理生化指标均优于对照,而且有1个转基因植株(MseNHX75)所测定耐盐相关生理生化指标均优于其他转基因植株。加代培养获得T1代植株,经PCR鉴定筛选获得了T1代转基因株系。 4、首次克隆了紫花苜蓿阿尔冈金盐诱导表达基因MsPRP2启动子序列,大小为1521 bp,与GenBank中报道的序列(AF028841)的同源性为93.7%,且含有2个大的AT富含区和1个G-box。成功构建了盐诱导型启动子驱动SeNHX1基因的植物双元表达载体pPZP221(MsPNN),并利用农杆菌介导法转化紫花苜蓿阿尔冈金,获得转化再生植株。
【学位授予单位】:内蒙古大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S541.9

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