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普氏原羚—牛异种动物克隆研究

郜宇  
【摘要】:普氏原羚(Procapra przewalskii),亦称普氏小羚羊,是世界上最濒危物种之一,为中国特有珍惜濒危物种。属偶蹄目、牛科、羚羊亚科、原羚属动物,历史上曾分布于内蒙古、甘肃、宁夏和青海。它形态大小与藏原羚相似,曾被看作是藏原羚的一个亚种,实为独立种。本研究以普氏原羚的成体细胞作为核供体,以牛的卵母细胞作为受体胞质,进行异种克隆操作,探讨普氏原羚异种克隆的可行性。从青海野生动物园的一只健康成年普氏原羚的耳源部采得约0.5cm2的组织1块,经体外培养后,得到成纤维细胞。从细胞水平对普氏原羚体细胞培养、生长曲线测定、核型制备与分析、细胞周期、转染条件的优化等方面进行了较为系统的研究。从屠宰场收集牛卵巢,采得卵丘卵母细胞复合体,经体外培养后,获得成熟卵母细胞。使用去乙酰化酶抑制剂处理异种重构胚,采用常规体细胞核移植技术和改进后的反向核移植技术,观察了普氏原羚异种克隆胚的发育情况。结果如下: 1、普氏原羚成纤维细胞培养在38.5℃, CO2浓度为5.0%的条件下,经过0.5%血清饥饿处理2天,当细胞的汇合度为50%-60%,70%-80%,95%-100%时,G0/G1期细胞的百分比分别为77.03%,77.51%和92.25%。长满后(接触抑制使细胞大部分处于G0/G1期)的体细胞与血清饥饿处理的体细胞在进行核移植时,效果是一致的。细胞成梭型长条状或不规则多角形、边缘清晰。经细胞冷冻、复苏后,细胞活力无明显改变。细胞的染色体数目为60条,但是随着培养代次的增加,染色体的非整倍性会逐渐增加,表明体外培养系统会对细胞染色体倍性产生一定影响。用脂质体介导的红色荧光蛋白(pDS-Red2)和Oct-4-eGFP转染普氏原羚成纤维细胞,最佳的转染条件是15μl Lipfectamine LTX及4μg质粒DNA的转染体系。 2、分别以不同浓度的去乙酰化酶抑制剂Valproic acid (VPA)对普氏原羚-牛异种重构胚处理不同时间,观察克隆胚胎的发育。结果表明,0.5mM的VPA处理24h可以显著提高克隆胚胎8-16细胞的发育率(61.9%vs50.7%)。但是,与未处理的对照组相比,异种克隆胚胎的桑椹胚和囊胚发育都没有显著性差异(1.2%vs1.6%, P0.05;0.8%vs1.6%, P0.05);用0.5mM的VPA处理转基因细胞来源(Oct-4-eGFP)的异种重构胚,观察异种重构胚的发育。结果表明,经VPA处理24h后,试验组与对照组在卵裂率(78.4%vs71.4%)、8-16细胞发育率(62.1%vs58.5%)、桑椹胚发育率(1.3%vs1.9%)和囊胚发育率(0.7%vs1.3%)等方面均没有显著差异(P0.05);用30nM的Trichostatin A (TSA)处理重构胚24h,观察异种重构胚的发育情况。TSA处理组在各个时期显著高于对照组,囊胚率也得到明显提高(3.6%/3.0%vs0.8%/0.9%,P0.05),获得3枚表达绿色荧光的转Oct-4-eGFP的普氏原羚-牛的异种克隆囊胚;通过反向核移植法进行异种核移植操作,观察异种重构胚的发育情况。结果表明,在卵裂率(61.1%vs63.5%)和8-16细胞发育率(45.6%vs49.0%)上没有显著性差异,实验组得到1枚囊胚;为了探索普氏原羚-牛的异种克隆胚胎发育低的问题,本研究还对异种重构胚、受体卵母细胞、供体细胞、牛-牛同种克隆胚胎等进行了芯片检测。结果显示,与供体细胞、卵母细胞相比,8-16细胞期异种重构胚激活643个基因,而8-16细胞期牛克隆胚胎激活了1527个基因。异种重构胚只激活了部分与重编程相关的基因。与牛体细胞相比,普氏原羚体细胞中有1010个基因没有被有效沉默。提示异种来源的供体细胞在核重编程过程中进行的不彻底。 以上结果表明,虽然牛的卵母细胞质可以支持普氏原羚体细胞发生重编程,异种重构胚可以发育到囊胚,但是囊胚发育率均很低。利用VPA处理重构胚未能提高囊胚发育率;而TSA处理重构胚明显提高了囊胚发育率;异种囊胚能够表达重编程因子0ct-4。组学分析初步表明,异种重构胚只能激活部分与重编程相关的胚胎发育基因,供体细胞的基因还在持续表达,母源性mRNA在异种重构胚降解可能受到阻碍。


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