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《内蒙古大学》 2017年
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Centromere protein F在小鼠卵母细胞减数分裂及早期胚胎发育过程中的功能研究

周成杰  
【摘要】:Centromere protein F(CENPF)是一个含有亮氨酸拉链及卷曲螺旋结构域的动粒蛋白,属于着丝粒蛋白家族成员。同时CENPF也是一个多功能蛋白,在有丝分裂中对细胞增殖、囊泡运输及细胞形变等过程具有重要的调控作用,这些功能的发挥依赖于CENPF跟微管蛋白(Microtubule,MT)的相互作用。然而,目前对于CENPF在小鼠卵母细胞减数分裂及早期胚胎发育过程中的功能所知甚少。因此,我们的研究将重点对CENPF在小鼠卵母细胞减数分裂及早期胚胎发育过程中的功能进行详细探讨。在第一部分(第二章)研究中,我们对CENPF在小鼠卵母细胞减数分裂中的功能进行了研究。首先探讨了 CENPF在小鼠卵母细胞减数分裂各个时期的蛋白表达及亚细胞定位情况,对CENPF在卵母细胞中的定位机理进行了初步探讨。其次,利用Cenpf特异性的siRNA及Morpholino(MO)对CENPF表达进行敲减,进一步研究CENPF在小鼠卵母细胞减数分裂中的功能。最后,对CENPF调控小鼠卵母细胞减数分裂过程潜在的作用机理进行了研究。在本章研究中,收取GV、GVBD、MI、AI-TⅠ及MⅡ期卵母细胞,利用免疫印迹及免疫荧光技术对CENPF进行蛋白定量及定位研究。免疫印迹结果显示,CENPF在减数分裂的各个时期均有表达,在GV期表达量较低,在减数分裂中期(MⅠ期及MⅡ期)表达量较高。免疫荧光结果显示,CENPF在GV期定位于细胞核的核膜。随着卵母细胞发生GVBD,CENPF开始定位于纺锤体,并持续到减数分裂结束,除TⅠ期外,CENPF还定位于着丝粒上。为了探究CENPF的定位机制,我们利用微管干扰药物Nocodazole(促进微管解聚)和Taxol(抑制微管解聚)处理MⅡ期卵母细胞,结果发现CENPF在纺锤体上的定位依赖于微管蛋白的稳定,在着丝粒上的定位则不依赖于微管蛋白。进一步利用法尼基转移酶抑制剂(Farnesyl Transferase Inhibitor,FTI)SCH66336 处理卵母细胞,发现CENPF在GV及MⅠ期的定位不依赖于自身的法尼基化,在MⅡ期的定位则依赖于自身的法尼基化。Cenpf-siRNA及CENPF-MO对CENPF功能干扰的实验结果表明,CENPF缺失会导致GVBD及第一极体排放(First polar body extrusion,PBE)失败。TUBB及DNA免疫荧光染色结果显示,CENPF缺失导致纺锤体组装缺陷及染色体中期板集合失败。eGFP-TUBB及mCherry-H2B实时观察结果进一步表明,CENPF缺失后,纺锤体组装失败,染色体无法正确排列到中期板,进而导致减数分裂失败。染色体铺片结果显示,CENPF缺失导致MⅡ期卵母细胞染色体的异倍性显著升高。对减数分裂失败并停滞在MⅠ期的卵母细胞研究发现,虽然染色体稳定性暂时没有受到影响,但因为姐妹染色单体着丝粒间距变宽,从而有可能导致后期染色体异倍性发生的概率增加。最后,通过CREST及TUBB免疫荧光染色发现,CENPF缺失导致微管-动粒连接缺陷,染色体无法被微管蛋白抓取。同时CENPF缺失导致纺锤体组装检验点(Spindle Assembly Checkpoint,SAC)相关蛋白Mad1及Mad2激活,从而导致中后期转换受到抑制。综上所述,CENPF缺失导致微管组装及微管对动粒捕捉失败,最终导致SAC持续激活。由于SAC处于激活状态,一部分卵母细胞无法完成减数分裂中后期转换,最终导致卵母细胞成熟失败。而对于部分"逃离"SAC监控的卵母细胞,虽能完成减数分裂,但由于纺锤体组装异常,且微管-着丝粒连接不稳定,染色体无法正常分离,最终导致这部分MⅡ期卵母细胞形成异倍体的概率增加。在第二部分(第三章)研究中,我们对CENPF在小鼠早期胚胎发育过程中的作用进行了详细探究。首先,探讨了 CENPF在小鼠早期胚胎各个时期的蛋白表达及亚细胞定位情况,对CENPF在早期胚胎的定位机理进行了初步探讨。其次,在MⅡ、PN及2-cell期注射CENPF-MO,进一步研究CENPF敲减对早期胚胎发育的影响。收取受精后 AⅡ-TⅡ、PN、Late 1-cell、2-cell、4-cell、8-cell、桑葚及囊胚期胚胎,利用免疫印迹及免疫荧光技术进行CENPF蛋白定量及定位研究。免疫印迹结果显示,CENPF在早期胚胎发育的各个时期均有表达,从8-cell开始蛋白表达量逐渐减少。免疫荧光结果显示,在有丝分裂间期,CENPF定位于核膜及细胞间桥部位。进入分裂期,CENPF定位于纺锤体或者着丝粒上。我们利用FTⅠSCH66336处理PN期胚胎,发现CENPF在桑葚胚及囊胚中定位消失,说明在早期胚胎发育过程中,CENPF的定位同样依赖于自身的法尼基化。MⅡ期卵母细胞注射CENPF-MO后孤雌激活,观察胚胎发育情况。结果显示CENPF敲减导致早期胚胎发育失败,胚胎发育阻滞在4-cell或8-cell期,几乎无囊胚形成。PN期胚胎敲减CENPF的结果与MⅡ期卵母细胞敲减结果一致。为了更直观地观察CENPF敲减对早期胚胎发育的影响,将带有红色荧光基团的Ctrl-MO及带有绿色荧光基团的CENPF-MO分别注射到一个2-cell的两个卵裂球中,进行活细胞实时观察。结果表明,注射Ctrl-MO的卵裂球最终发育成囊胚,而注射CENPF-MO的卵裂球则无法形成囊胚。综上所述,CENPF在小鼠卵母细胞减数分裂及早期胚胎发育过程中发挥了重要作用。
【关键词】:CENPF 卵母细胞 减数分裂 早期胚胎发育
【学位授予单位】:内蒙古大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q132
【目录】:
  • 摘要5-9
  • ABSTRACT9-17
  • 缩略词表17-19
  • 第一章 文献综述 着丝粒蛋白F研究进展19-32
  • 1.1 引言19
  • 1.2 CENPF结构19-21
  • 1.3 CENPF在有丝分裂中的作用21-24
  • 1.3.1 CENPF在有丝分裂各时期表达及定位21
  • 1.3.2 CENPF缺失造成有丝分裂缺陷21-24
  • 1.4 法尼基化对CENPF的转译后修饰24-25
  • 1.5 CENPF与肿瘤发生25-26
  • 1.6 展望26
  • 参考文献26-32
  • 第二章 实验研究 CENPF在小鼠卵母细胞减数分裂中的功能研究32-76
  • 2.1 引言32-33
  • 2.2 实验材料与研究方法33-41
  • 2.2.1 实验材料33-36
  • 2.2.1.1 实验动物33
  • 2.2.1.2 实验仪器设备33-34
  • 2.2.1.3 实验相关试剂34-35
  • 2.2.1.4 抗体35-36
  • 2.2.2 研究方法36-41
  • 2.2.2.1 免疫印迹36-37
  • 2.2.2.2 免疫荧光染色37-38
  • 2.2.2.3 Cenpf-siRNA及CENPF-morpholino (MO)显微注射38-39
  • 2.2.2.4 药物处理39
  • 2.2.2.5 活细胞观察39-41
  • 2.2.2.6 统计学方法41
  • 2.3 实验结果及分析41-71
  • 2.3.1 CENPF在小鼠卵母细胞减数分裂过程中的蛋白表达及定位研究41-52
  • 2.3.1.1 Western Blot检测小鼠卵母细胞成熟各时期CENPF蛋白表达41-42
  • 2.3.1.2 免疫荧光检测CENPF在小鼠卵母细胞成熟各时期定位42-45
  • 2.3.1.3 微管干扰药物Nocodazole及Taxol处理卵母细胞后CENPF蛋白表达及定位研究45-48
  • 2.3.1.4 FTI SCH66336处理卵母细胞后CENPF蛋白表达及定位研究48-52
  • 2.3.2 CENPF在小鼠卵母细胞减数分裂过程中的功能研究52-71
  • 2.3.2.1 利用特异性Cenpf-siRNA敲减CENPF对卵母细胞成熟的影响52-55
  • 2.3.2.1.1 Cenpf-siRNA敲减效率检测52-53
  • 2.3.2.1.2 Cenpf-siRNA敲减造成卵母细胞GVBD及PBE失败53-54
  • 2.3.2.1.3 利用Cenpf-siRNA敲减CENPF导致MⅡ期卵母细胞染色体中期板集合及纺锤体组装异常54-55
  • 2.3.2.2 利用特异性CENPF-MO敲减CENPF对卵母细胞成熟的影响55-63
  • 2.3.2.2.1 CENPF-MO敲减效率检测56-57
  • 2.3.2.2.2 CENPF-MO敲减导致卵母细胞GVBD失败57-58
  • 2.3.2.2.3 特异性CENPF-MO敲减CENPF导致卵母细胞PB1排放失败58-59
  • 2.3.2.2.4 特异性CENPF-MO敲减CENPF导致纺锤体组装及染色体中期板集合异常59-63
  • 2.3.2.3 CENPF敲减后MⅠ期及MⅡ期卵母细胞染色体分析63-66
  • 2.3.2.3.1 CENPF敲减导致MⅡ期卵母细胞异倍性的增加63-64
  • 2.3.2.3.2 CENPF敲减导致MⅠ期卵母细胞姐妹染色单体动粒间距变宽64-66
  • 2.3.2.4 CENPF在减数分裂中作用机理的初步探究66-71
  • 2.3.2.4.1 CENPF缺失导致纺锤体抓取染色体失败66-68
  • 2.3.2.4.2 CENPF缺失激活SAC68-71
  • 2.4 讨论71-73
  • 参考文献73-76
  • 第三章 实验研究 CENPF在小鼠早期胚胎发育过程中的功能研究76-102
  • 3.1 引言76-77
  • 3.2 实验材料与研究方法77-79
  • 3.2.1 实验材料77
  • 3.2.1.1 实验动物77
  • 3.2.1.2 实验仪器设备77
  • 3.2.1.3 实验相关试剂77
  • 3.2.2 研究方法77-79
  • 3.2.2.1 Western Blot免疫印迹77
  • 3.2.2.2 免疫荧光染色77-78
  • 3.2.2.3 体外受精及早期胚胎发育78
  • 3.2.2.4 MⅡ期卵母细胞、PN期胚胎及2-cell期胚胎的CENPF-morpholino (MO)显微注射78
  • 3.2.2.5 SCH66336药物处理78-79
  • 3.2.2.6 活细胞观察79
  • 3.2.2.7 统计学方法79
  • 3.3 实验结果及分析79-99
  • 3.3.1 CENPF在小鼠早期胚胎发育过程中的蛋白表达及定位研究79-88
  • 3.3.1.1 Western Blot检测CENPF在小鼠早期胚胎发育各个时期的表达79-80
  • 3.3.1.2 免疫荧光检测CENPF在小鼠早期胚胎发育各个时期定位80-82
  • 3.3.1.3 FTI (SCH66336)处理小鼠早期胚胎后CENPF蛋白表达及定位研究82-88
  • 3.3.2 CENPF在小鼠早期胚胎发育过程中的功能研究88-99
  • 3.3.2.1 MⅡ期卵母细胞注射CENPF-MO对小鼠早期胚胎发育的影响88-91
  • 3.3.2.2 PN期胚胎注射CENPF-MO对小鼠早期胚胎发育的影响91-94
  • 3.3.2.3 2-cell期胚胎注射CENPF-MO对小鼠早期胚胎发育的影响94-99
  • 3.4 讨论99-100
  • 参考文献100-102
  • 结论102-103
  • 附录103-109
  • 致谢109-112
  • 攻读学位期间发表的学术论文112

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