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《内蒙古大学》 2017年
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三个甜瓜ERF基因的克隆及初步功能分析

鲍牧兰  
【摘要】:ERF(ethylene responsive factor)与乙烯信号转导相关,是一类位于信号途径下游的转录因子,可参与逆境应答、植物生长发育和果实的成熟。ERF转录因子属于AP2/EREBP家族中的EREBP亚族,包含一个AP2/ERF结合域。在甜瓜(Cucumis melo L.)中已经克隆得到若干ERF转录因子基因,但与甜瓜果实成熟相关研究报道较少。甜瓜属于葫芦科甜瓜属,果实具有丰富的营养,因此,深入研究与甜瓜果实成熟相关的ERF转录因子功能已经成为必要。本研究根据甜瓜数据库序列分别克隆得到三个ERF转录因子CmERF Ⅲ-12、CmERF Ⅲ-14、CmERF Ⅴ-2基因,分别编码275、148、391个氨基酸,利用生物信息学软件进行蛋白理化性质、磷酸化位点、信号肽结构、跨膜结构等相关性质预测。结果表明三个转录因子都具有亲水性,有不同的磷酸化位点,不属于分泌型蛋白,不具有跨膜结构,也不属于膜蛋白;亚细胞定位预测显示CmERFV-2和CmERFⅢ-14很可能定位于细胞核,CmERF Ⅲ-12在细胞质内分布较多,因此三个转录因子可能分别在细胞核和细胞质内发挥着调控作用。为研究其初步功能,构建CmERF Ⅲ-12、CmERF Ⅲ-14、CmERF Ⅴ-2基因超表达载体和RNAi干扰载体,利用农杆菌注射法在甜瓜果实中进行瞬时表达,通过实时定量PCR分别检测转化部位三个基因的表达特性和果实成熟相关基因的相对表达量。结果显示,注射CmERF Ⅲ-14基因超表达载体部位果皮颜色出现提前变黄表型,注射干扰载体部位仍保持绿色;注射CmERF Ⅴ-2基因超表达部位果皮颜色保持绿色,注射干扰载体部位出现变黄表型;分别注射CmERF Ⅲ-12基因超表达与干扰载体部位的果皮颜色表型不明显。注射组织实时定量PCR检测结果显示:CmERF Ⅲ-14基因的过表达和干扰处理分别会激活和抑制果实成熟相关ACS4、EXP1、PSY1基因的表达。CmERF Ⅴ-2基因的过表达能抑制EXP1基因的表达。结合表型结果,CmERF Ⅴ-2基因可能推迟果实的成熟而CmERF Ⅲ-14基因会促进果实的成熟,CmERF Ⅲ-12基因则对果实成熟的影响不大。构建携带有果实特异表达E8基因启动子的报告载体pPZP-E8-GUS,以分别携带目的基因超表达载体为效应载体,通过叶片注射法共转化本氏烟草(Nicotiana benthamiana)根据GUS活性变化,CmERF Ⅲ-12、CmERF Ⅲ-14转录因子基因能够激活果实特异性E8启动子促进基因的表达而增加GUS酶的相对活性,而CmERF Ⅴ-2则倾向于抑制E8启动子降低GUS基因的表达而影响酶的相对活性。
【学位授予单位】:内蒙古大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S652;Q943.2

【参考文献】
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