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《内蒙古大学》 2017年
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环腺苷酸激活剂和磷酸二酯酶抑制剂对小鼠卵母细胞成熟效果的研究

吴雪臣  
【摘要】:从出生到青春期,作为雌性配子的卵母细胞一直停滞在第一次减数分裂的前期,又称生发泡(Germinal Vesicle,GV)期。只有在青春期后,受到激素刺激的卵母细胞才会发生生发泡破裂(Germinal Vesicle Breakdown,GVBD),进而开始恢复减数分裂,而只有恢复减数分裂并发育成熟的卵母细胞,才有可能与精子结合形成受精卵。哺乳动物卵母细胞中,磷酸二酯酶(Phosphodiesterases,PDEs)水平的变化引起的环腺苷酸(cyclic Adenosine Monophosphate,cAMP)水平的下降被认为是引起GVBD的主要原因。cAMP相关抑制剂如PDEs抑制剂和cAMP激活剂等,能可逆地抑制GVBD。为了检测不同种类、不同浓度以及不同组合的抑制剂对GV期卵母细胞的抑制效果和毒性作用,本实验选用PDEs抑制剂Milrinone(Mil)、3-Isobutyl-l-Methylxanthine(IBMX)和 cAMP 激活剂 Forskolin、dibutyryl cAMP(dbcAMP)四种药物分别进行单独或组合使用,以便于我们摸索出一套对卵母细胞成熟抑制效果最佳、对卵母细胞毒性最小的抑制剂配方。实验结果表明,在单独使用每种抑制剂的实验中,Mil,IBMX,Forskolin和dbcAMP能够达到抑制GVBD的最小浓度分别为3.0 LM、30.0 μM、450.0 μM和150.0 μM。为了进一步验证将各类抑制剂组合使用,能否获得更佳的配方,我们将不同种类和浓度的抑制剂进行组合,结果发现50.0 μM Forskolin + 0.3μM Mil,50.0 μM Forskolin+10.0 μM IBMX,50.0 μM dbcAMP + 0.3 μM Mil,50.0 μM dbcAMP + 10.0 μM IBMX四种组合能够获得更好的抑制GVBD效果。在此基础上,以不含任何抑制剂的培养液为对照组,含有不同种类抑制剂的培养液作为实验组,对卵母细胞的GVBD进程进行了检测,结果发现,含有抑制剂的实验组与对照组相比,GVBD进程不完全一致,但各组的最终GVBD率没有显著差异。我们进一步比较了不同抑制剂对卵母细胞第一极体(First Polar Body,PB1)排放的影响,结果显示,三个实验组在PB1排放速率和最终排放率上与对照组没有显著差异,包括:30.0 μM IBMX、50.0 μM Forskolin + 0.3 μM Mil、50.0 μM dbcAMP + 10.0 μM IBMX;另有三个实验组只在最终PB1排放率上和对照组没有显著差异,包括:150.0 μMdbcAMP、50.0 μMForskolin+10.0 μMIBMX、50.0 μMdbcAMP + 0.3μMMil。此外,我们比较了各组之间排放的PB1体积,结果发现,经 50.0 μM Forskolin + 0.3 μM Mil、50.0 μM Forskolin + 10.0 μM IBMX或50.0 μM dbcAMP + 10.0 μM IBMX三组处理过的卵母细胞所排放的PB1体积较小,并且与对照组没有显著差异。我们进一步检测了抑制剂对卵母细胞早期凋亡、DNA损伤和线粒体分布的影响,结果发现,经五种抑制剂处理卵母细胞后,其早期凋亡率与对照组没有显著差异,包括:30.0 μM IBMX、150.0 μM dbcAMP、50.0 μM Forskolin + 0.3μMMil、50.0 μM Forskolin + 10.0 μM IBMX、50.0 μM dbcAMP + 10.0 μM IBMX。经三种抑制剂处理卵母细胞后,其DNA损伤程度与对照组没有显著差异,包括:50.0 μM Forskolin + 0.3 μM Mil、50.0 μM Forskolin + 10.0 μM IBMX、50.0μM dbcAMP + 10.0 IBMX。在线粒体分布指标方面,只有50.0 μM dbcAMP+ 10.0 μMIBMX组与对照组没有显著差异。综合上述实验结果,我们得到如下实验结论:不同种类抑制剂经过浓度调整和组合使用,可以更好的将卵母细胞阻滞在GV期,并且对卵母细胞的毒性作用最小。由此,我们摸索出了新一代最佳抑制剂组合,即50.0 μMdbcAMP +10.0 μMIBMX。这一配方可为日后研究卵母细胞成熟机理提供有效帮助。
【学位授予单位】:内蒙古大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q492.5

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