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《内蒙古大学》 2017年
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利用显微注射技术制备CRISPR/Cas9介导的FGF5敲除及Noggin过表达转基因小鼠及其鉴定

张晓枫  
【摘要】:毛囊的生长发育过程受到一系列生长因子和信号通路的调控,成纤维细胞生长因子家族和骨形成蛋白家族就是其中两种参与调控的生长因子。FGF5在影响被毛长度方面的作用现已被广泛证实,Noggin主要通过抑制BMPs功能的发挥进而参与毛囊生长发育的调控。CRISPR/Cas系统作为一种新兴的第三代基因编辑技术,有简便易行、省时高效的优势,其应用对于畜牧育种而言可以大大提高育种的效率,缩短育种时间,减少育种成本,也可以实现许多之前难以完成的工作。本研究的出发点是希望利用CRISPR/Cas系统和原核显微注射技术构建FGF5、Noggin双基因编辑小鼠模型,通过研究这两个基因对毛囊发育的影响,为加快优良产绒性状绒山羊新品种培育工作提供参考。本实验通过脱毛实验观察小鼠的毛发生长速度;通过石蜡切片HE染色的方法检测小鼠皮肤毛发的再生情况及毛囊分布和毛干数目的变化;通过实时定量PCR检测阳性小鼠皮肤组织中与毛囊发育相关基因的表达情况。1、转基因小鼠的制备通过原核显微注射法将基于CRISPR/Cas9系统作用机理构建的FGF5-gRNA、pKI-Noggin载体以及Cas9质粒注入小鼠受精卵原核中,最终移植268枚注射后胚胎,获得36只新生小鼠,经鉴定,共获得6只不同类型阳性小鼠,分别是3只FGF5基因敲除小鼠、2只Noggin基因过表达小鼠和一只FGF5基因敲除且Noggin基因过表达的小鼠,总阳性率为16.7%。2、转基因小鼠的检测通过脱毛实验、石蜡切片、实时定量PCR技术检测阳性小鼠和野生型小鼠。结果表明,与野生型小鼠相比,FGF5基因敲除小鼠毛发生长速度相对较慢,毛囊独立生长,但分布较为杂乱,毛囊直径基本不变,毛囊数量增多;Noggin基因过表达小鼠毛发生长速度次之,毛囊成簇集聚生长,分布较为整齐,毛囊直径变大,毛囊数量减少;FGF5基因敲除同时Noggin基因过表达的小鼠毛发生长速度最慢,毛囊成簇集聚生长,分布较为整齐,毛囊直径变大,毛囊数量减少。实时定量PCR检测结果显示,92号、601号Noggin基因过表达小鼠,633号FGF5基因敲除同时Noggin基因过表达小鼠皮肤组织中Noggin基因的mRNA水平的相对表达量分别是野生型小鼠的2.67、8.36、35.35倍,三只阳性小鼠在mRNA水平都表达了Noggin基因。另外,三种不同类型小鼠的β-catenin、VEGF、Tβ4三个基因的mRNA的相对表达量较野生型小鼠也有不同程度的上调。
【学位授予单位】:内蒙古大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q78;S827

【参考文献】
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