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《内蒙古大学》 2017年
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CRISPR/Cas9介导绒山羊Tβ4基因定点敲入的研究

李晓聪  
【摘要】:作为毛纺产业的优质原材料,绒山羊所产的羊绒纤细柔软。但如今在绒山羊育种过程中存在为提高羊绒产量盲目杂交,造成羊绒质量降低等问题,亟待以现代生物技术实现品种改良。胸腺素β4(Thymosinbeta4,Tβ4)可以诱导毛囊形成进而调节哺乳动物毛发生长,加速毛囊干细胞的分化、迁移,还可通过促进血管生成达到间接促进毛发生长的作用。本实验利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在绒山羊骨骼肌卫星细胞上进行Tβ4基因的定点敲入,结合体细胞核移植技术获得Tβ4基因定点敲入的绒山羊,为绒山羊的遗传育种提供新的方法。1、Tβ4基因定点整合载体的构建使用麻省理工学院的CRISPR设计软件在CCR5的第二外显子上设计了 6对20bp的靶序列,以gRNA-T2为模板,使用整体PCR的方法,扩增得到大小为455bp的gRNA。利用surveyor突变检测试剂盒进行效率检测,最终确定了一对突变效率较高的gRNA,用于下一步实验。同时构建了由上游同源臂、Kap6.1启动子、Tβ4基因、polyA和下游同源臂5部分组成的Tβ4同源重组载体。2、Tβ4基因定点整合单克隆细胞系的获得采用电穿孔转染法将Cas9环状质粒、455bp的gRNA和线性化的Tβ4同源重组载体共同转入绒山羊骨骼肌卫星细胞中,利用流式细胞仪法、口吸管法和无限稀释法三种方法进行单克隆细胞系的分选。将获得的单克隆细胞进行基因组提取、PCR扩增及测序,筛选出Tβ4基因定点整合的单克隆细胞系。本实验利用流式细胞仪法获得124株单克隆细胞,1株发生Tβ4基因定点整合,定点整合效率为0.81%。利用口吸管法及无限稀释法获得76株单克隆细胞,4株细胞发生Tβ4基因定点整合,定点整合效率为5.3%。3、Tβ4基因定点整合绒山羊的制备利用体细胞核移植技术将Tβ4基因定点整合的单克隆细胞与去核的卵母细胞融合,构成重构胚。重构胚激活后开始进行体外发育培养,将卵裂球均匀的克隆胚胎用于胚胎移植。本实验从266个卵巢中共采集卵母细胞1227个,体外培养成熟卵母细胞761个,成熟率为62%。利用显微操作技术共获得重构胚708枚,重构胚在电击融合后,有545枚发生融合,融合率达76.9%。融合的重构胚激活后在体外进行培养开始卵裂,共有343枚重构胚发生了卵裂,卵裂率达62.9%。将卵裂的343枚重构胚移入94只受体羊中,其中4只受体羊顺利产羔,羔羊生长状态良好。采血样经PCR初步鉴定,其中1只羔羊实现了 Tβ4基因定点整合,其余3只羔羊仍在进一步检测中。本研究利用CRISPR/Cas9技术成功获得了 Tβ4基因定点整合的绒山羊,为今后利用该技术培育绒山羊新品种提供了实验基础。
【学位授予单位】:内蒙古大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q78;S827

【参考文献】
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