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《内蒙古大学》 2017年
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利用CRISPR/Cas9系统对本氏烟草基因编辑的基础研究

刘亚娟  
【摘要】:CRISPR/Cas9是发现于古细菌和细菌中的一种获得性免疫防御机制,通过摄取入侵的外源DNA短片段最终形成宿主的间隔序列,从而介导对病毒和质粒的获得性抗性。由于该系统相对于以前的基因编辑方法更简单易行、可靠高效、靶标精准而被广泛应用到多种生物的基因编辑中,成为一个准确打靶的基因编辑工具。本研究以本氏烟草为材料,利用CRISPR/Cas9技术实现本氏烟草内源PDS(Phytoenedesaturase,八氢番茄红素脱氢酶)基因和外源GFP(Green Fluorescent Protein,绿色荧光蛋白)基因的编辑工作,建立了本氏烟草CRISPR/Cas9系统基因编辑的瞬时表达系统和稳定遗传转化体系,进而探讨了 CRISPR/Cas9系统在植物基因组编辑中的应用,为将来开展其它内源基因的生物学功能研究奠定了基础。本论文针对本氏烟草内源基因PDS和外源基因GFP分别预测了 3个和4个靶标位点,并设计合成了相应的guide序列和构建了双元表达重组载体。其中,将中间克隆载体psgR-Cas9-At质粒成功地改造成了操作性强的In-Fusion克隆载体psgR-Cas9-IF-At。将成功构建的双元表达重组载体转化到农杆菌中并通过注射法侵染本氏烟草叶片。GFP基因的4个guide序列重组子转化的农杆菌分别侵染转基因本氏烟草 16C-NB(16C transgenic Nicotiana benthamiana,16C-NB)叶片(16C-NB过表达GFP基因),通过基因组DNAPCR-RE方法验证CRISPR/Cas9系统的编辑效果,PCR-RE结果显示只有GFP-guide-1和GFP-guide-3有编辑效果。PDS基因的3个靶标序列重组子转化的农杆菌侵染野生型本氏烟草 17WT-NB(17 Wild Type-Nicotiana benthamiana)叶片,通过基因组DNA RE-PCR方法验证该系统的编辑效果,RE-PCR结果初步显示PDS-guide-1有编辑效果。本论文将PDS基因的3个guide序列两两组合(即PTG-1+2,PTG-1+3,PTG-2+3)进行多位点编辑试验来进一步验证CRISPR/Cas9系统的编辑效果。将两两组合的guide序列克隆到双元表达载体中并转化到农杆菌中侵染本氏烟草17WT-NB,通过PCR方法检测其编辑效果,PCR结果初步显示只有PTG-1+2有编辑效果。在以上工作基础上,针对PDS-guide-1进行农杆菌介导的叶盘遗传转化实验以期获得单个位点编辑的转基因植株。通过该方法获得了 99株转基因植株,PCR结果显示45株阳性植株,但最终成活22株阳性植株,此结果为获得稳定遗传的PDS基因编辑植物打下了基础。
【学位授予单位】:内蒙古大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q943.2

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