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《内蒙古大学》 2018年
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金黄色葡萄球菌多抗原疫苗的构建及免疫保护效应的研究

胡仲鹏  
【摘要】:金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)是引起人类和动物感染的重要病原菌,严重危害人类和动物健康。目前尚无有效的可用于临床的疫苗问世。以往的研究表明多抗原混合疫苗或配伍新型佐剂是当今金黄色葡萄球菌疫苗研究的优势策略。本试验采用了S.aureus的ESAT-6样分泌系统A、B蛋白(EsxA、EsxB)、α-溶血素(Hla)和铁-异羟肟酸摄取蛋白D2(FhuD2)作为候选抗原。首先将EsxA、EsxB的CDS区序列进行了融合。将Hla核苷酸序列改变,使其表达无毒蛋白Hla_(H35L)。将EsxA-EsxB、Hla_(H35L)和FhuD2的DNA序列与原核表达载体pEasy-Blunt-E1连接,形成重组原核表达载体pEasy-Blunt-E1-EsxA-EsxB、pEasy-Blunt-E1-Hla_(H35L)和pEasy-Blunt-E1-Fhu D2。将三个重组载体转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,诱导目的蛋白表达。经过镍柱Ni-NTA和分子筛CL-4B纯化,最终得到高纯度的EsxA-EsxB、Hla_(H35L)和FhuD2蛋白。将EsxA-EsxB、Hla_(H35L)和Fhu D2三种蛋白混合,配伍完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗佐剂(IFA)制成多抗原混合疫苗(EsxA-Esx B+Hla_(H35L)+FhuD2+CFA/IFA),同时将EsxA-EsxB、Hla_(H35L)和FhuD2三种蛋白分别配伍CFA/IFA,制成单抗原疫苗(EsxA-EsxB+CFA/IFA、Hla_(H35L)+CFA/IFA和FhuD2+CFA/IFA)。用上述疫苗免疫小鼠,对三次免疫后的小鼠攻毒,使其肺部感染S.aureus,检测各组小鼠体温变化,统计各组小鼠存活率、肺部载菌量,观察各组小鼠肺脏病理变化。通过与三种单价疫苗免疫小鼠后保护效果对比,探究混合抗原疫苗(Esx A-Esx B+Hla_(H35L)+FhuD2+CFA/IFA)的免疫保护效应。结果发现,相比于单独抗原免疫组,混合抗原免疫组提高了小鼠感染金葡菌后的生存率(88.9%),减轻了小鼠肺部病变程度,减少了小鼠肺部金葡菌的定植量。为评价免疫后小鼠的体液和细胞免疫应答水平,用ELISA法检测了针对不同抗原的特异性抗体应答水平。MTS法检测了免疫后小鼠脾脏T淋巴细胞在抗原体外刺激下细胞增殖情况以及分泌的IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-17A的水平。同时应用胞内细胞因子染色和流式细胞术检测了小鼠脾脏中的IFN-γ~+CD4~+T细胞、IL-4~+CD4~+T细胞和IL-17~+CD4~+T细胞占总脾脏T淋巴细胞的比例。结果发现,与单独免疫组相比,混合免疫组针对不同抗原的特异性抗体应答水平显著提高,极大的提高了抗原特异性T细胞增殖反应能力。混合免疫组脾脏细胞中IFN-γ~+CD4~+T细胞、IL-4~+CD4~+T细胞和IL-17~+CD4~+T细胞占脾脏总T淋巴细胞的比例均高于其他各组。本研究的第二部分使用混合抗原(EsxA-EsxB、Hla_(H35L)和FhuD2)配伍多糖佐剂EPS029制成新型的多抗原疫苗,通过观察小鼠存活率、肺脏的病理变化程度以及肺部载菌量等指标,对免疫保护效果进行了评价。结果发现,与混合抗原无佐剂组(EsxA-EsxB+Hla_(H35L)+FhuD2)的小鼠相比,EPS029作为免疫佐剂,够有效地提高小鼠感染金葡菌后的生存率(88.9%),并且能够显著减少金葡菌对肺部的病理损害以及在肺部的定植。对其免疫应答特征进一步研究后发现,EPS029作为金葡菌混合抗原疫苗的佐剂使用时,可以增强抗原特异性Ig G1、IgG2a和IgG2b抗体应答水平,同时极大的提高了抗原特异性T细胞增殖反应能力以及IFN-γ、IL-4和IL-17A的分泌量,并且小鼠脾脏细胞中IFN-γ~+CD4~+T细胞、IL-4~+CD4~+T细胞和IL-17~+CD4~+T细胞占总T细胞的比例均高于其他各组。提示EPS029作为金葡菌混合抗原的佐剂,可以同时提高机体Th1型、Th2型和Th17型免疫应答。以上结果表明,基于金黄色葡萄球菌的多抗原(EsxA、EsxB、Hla和FhuD2)疫苗成功构建,并且该疫苗配伍新型免疫佐剂EPS029可以有效保护小鼠对金葡萄球菌的感染,为研发对抗S.aureus感染的新型疫苗提供理论依据和实验依据。
【学位授予单位】:内蒙古大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:Q939.91

【参考文献】
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【共引文献】
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