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《内蒙古大学》 2018年
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扁蓿豆DREB转录因子家族同源基因MrDREB1的克隆和功能鉴定

张凤  
【摘要】:本研究利用黄花苜蓿中已知的DREB转录因子氨基酸序列保守区设计简并引物,以无菌培养三周的扁蓿豆幼苗叶片总RNA为模板,通过RT-PCR克隆得到201bp的cDNA保守区片段,利用RACE技术最终克隆得到778bp的全长cDNA片段(GeneBank登录号:MF977759)。生物信息学分析表明,扁蓿豆MrDREB1氨基酸无信号肽结构,属于非分泌性蛋白,不具有跨膜结构,属于非跨膜蛋白,与截形苜蓿和黄花苜蓿等豆科植物的DREB转录因子在进化上亲缘关系相对较近。以植物双元表达载体p KGWRR作为基本载体骨架,利用GateWay技术构建Mr DREB1基因过表达载体、tasiRNA介导的MrDREB1基因沉默载体和对照载体,运用冻融转化法将重组质粒转入到发根农杆菌Arqua1中。运用毛根转化法将三种重组质粒(过表达载体、tasiRNA介导基因沉默载体、对照载体)转入扁蓿豆根组织中无菌培养2周,每种载体做三组实验重复。荧光体视显微镜下检测根组织转化有外源基因的扁蓿豆植株,每种转化体各选取长势基本一致的26株幼苗分别进行不同的胁迫处理(0℃、300mM Mannitol、200mM NaCl)10天,之后测量、统计胁迫处理后根组织的生长长度、根鲜重等表型指标;单株提取根组织总RNA,Q-PCR检测抗逆相关基因Mr PP2C和受MrDREB1调控的抗逆基因MrCAS15A的相对表达量。研究结果显示在不同非生物逆境胁迫处理条件下,过表达MrDREB1和tasiRNA介导的MrDREB1沉默的扁蓿豆根组织的长度和根重都和对照有显著差异,其中低温胁迫处理后的表型差异最显著,初步说明外源扁蓿豆DREB转录因子在提高扁蓿豆抗低温等非生物胁迫能力方面发挥重要作用。Q-PCR结果表明,转基因扁蓿豆MrCAS15A、MrPP2C基因在超表达载体幼苗中的表达量均高于对照载体,而转化tasiRNA载体幼苗的表达量明显下降,结果表明外源Mr DREB1基因可以影响下游逆境胁迫应答相关基因的表达。
【学位授予单位】:内蒙古大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:Q943.2

【参考文献】
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