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《内蒙古大学》 2018年
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拟南芥Zinc Nutrition Essential 1(ZNE1)锌转运蛋白的功能鉴定

包向男  
【摘要】:锌(Zn)是动植物体内非常重要的一种微量元素,Zn营养平衡失调会影响动植物的生长和健康。本实验室前人发现在相对高的Zn~(2+)培养条件下,At3g08650的T-DNA插入拟南芥突变体幼苗生长受到抑制,叶片叶脉周围细胞早衰,即出现高锌敏感表型,表明At3g08650可能参与调控植物叶细胞Zn~(2+)营养平衡,因此将该基因命名为ZNE1(ZINC NUTRITION ESSENTIAL1)。本论文对ZNE1是否参与Zn~(2+)转运以及ZNE1功能位点的鉴定展开研究。首先将ZNE1克隆入酵母表达载体pFL61,并将其转化进Zn吸收缺失型酵母突变体zrt1zrt2(ZHY3)中进行酵母异源功能互补实验,结果显示,ZNE1基因使酵母突变株ZHY3恢复Zn~(2+)吸收功能,即证实ZNE1具有Zn~(2+)转运功能。随后为了鉴定ZNE1基因的功能位点,通过KinasePhos网站预测了ZNE1的10个磷酸化位点,并对其进行了单碱基(S39A,W105R,G115R,S133A,G144D,S185A,G189V,V192L,S560I,T584A),双碱基(S185A,G189V)以及三碱基(S185A,G189V,V192L)突变。将含有点突变的ZNE1基因克隆入pFL61质粒并转化进ZHY3中,实验结果显示,转化后的酵母突变株均不能使ZHY3恢复Zn~(2+)吸收功能,说明这10个磷酸化位点是Zn~(2+)转运相关的功能位点。最后我们通过等温滴定微量热法确定ZNE1的Zn~(2+)结合位点,通过TMHMM网站对ZNE1进行分析,发现其具有14个跨膜区域,膜外有8个短肽(被命名为outside1-8),膜内有7个短肽(被命名为inside1-7)。用超灵敏等温滴定微量热仪Micro Cal iTC200测定Zn SO_4滴定不同短肽的热力学数据,根据滴定曲线确定Zn~(2+)结合短肽,结果显示inside2和outside1是与Zn~(2+)发生结合反应的重要短肽。通过MicroCal i TC200以及酵母异源功能互补实验,进一步确定126位的赖氨酸和131位的组氨酸是ZNE1的Zn~(2+)结合位点。ZNE1功能的研究有助于揭示植物Zn稳态调控的分子机制,为后续培育合理的Zn营养作物奠定基础。
【学位授予单位】:内蒙古大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:Q946.1

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