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《内蒙古大学》 2019年
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LPS诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡的分子机制研究

丹丹  
【摘要】:奶牛乳腺炎是制约奶业发展的重要多发性疾病之一,给奶业带来巨大损失并危及人类健康。奶牛乳腺炎的主要病因是病原菌的侵入,其中大肠杆菌(Escherichia coli)是乳腺炎最常见的环境病原菌之一。大肠杆菌作为革兰氏阴性细菌,细胞外膜中存在内毒素——脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)。在奶牛乳腺炎发生过程中,LPS会通过发病乳腺组织进入到血液中引发全身性炎症以及脓毒血症。奶牛乳腺上皮细胞作为构成乳腺先天免疫屏障的重要组成部分,在抵抗病原菌入侵方面起关键作用,乳腺上皮细胞凋亡对乳腺炎的免疫防御具有重要意义。研究LPS诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡的分子机制,为奶牛乳腺炎的防治提供依据。本研究首先利用酶消化法体外分离得到奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)并纯化鉴定。其次,以此细胞为细胞模型,检测LPS处理对细胞增殖、炎性因子分泌、凋亡的影响,结果显示:(1)LPS抑制奶牛乳腺上皮细胞增殖;(2)LPS刺激奶牛乳腺上皮细胞分泌炎性相关因子TNF-α、IL-18,且具有一定的时间依赖性(p0.01);(3)LPS诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡,并且随LPS处理浓度和时间的增加,细胞凋亡率也有升高趋势。这预示着LPS可能通过炎性因子的表达诱导细胞凋亡,进而抑制细胞增殖。再次,通过分子细胞生物学手段研究LPS诱导细胞发生凋亡的途径。结果发现:(1)LPS刺激奶牛乳腺上皮细胞使TLR-4、MyD88和FADD表达增加,而Caspase-8前体蛋白表达量减少;(2)沉默MyD88基因,LPS刺激细胞炎性因子TNF-α的分泌量显著降低(p0.01),而沉默TIRAP基因,TNF-α的分泌量无显著变化(p0.05)。以上结果初步表明,LPS被膜受体TLR-4识别后,通过MyD88依赖型信号通路以及胞外死亡受体途径诱导细胞凋亡。最后,通过使用Rapamycin预处理细胞,探讨mTORC1信号通路对LPS诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡的调控作用。结果发现:(1)LPS激活奶牛乳腺上皮细胞mTORC1信号通路,Rapamycin减弱LPS诱导的mTORC1信号通路活性;(2)Rapamycin抑制LPS诱导的pro-Caspase-3蛋白的裂解;(3)Rapamycin减少LPS诱导的MyD88、FADD蛋白表达;(4)Rapamycin降低LPS诱导的转录因子STAT1的磷酸化水平。根据以上结果可以推测mTOR信号通路可能通过调控转录因子STAT1来调节LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞凋亡。总之,LPS可以诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡。LPS被细胞膜受体TLR4识别,募集衔接蛋白MyD88,构成LPS/TLR-4/MyD88信号通路,激活转录因子STAT1,分泌炎性因子TNF-α和IL-18;LPS刺激后FADD表达水平升高,pro-Caspase-8的表达量下降,预示着LPS可能是通过经典的死亡受体通路诱导细胞发生凋亡。mTORC1信号通路调控MyD88、FADD、Caspase-3等凋亡相关蛋白表达,这一过程可能是通过对转录因子STAT1活性的调节来实现的。
【学位授予单位】:内蒙古大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:S858.23

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