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《内蒙古大学》 2019年
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氧化性低密度脂蛋白介导NF-κB信号通路促进rBMSCs成骨分化的机制研究

王雅琴  
【摘要】:氧化型低密度脂蛋白(oxidized Low density Lipoprotein,oxLDL)及其中的生理活性磷脂是动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)发生的主要始动因素。已研究证明动脉粥样硬化发生发展过程中间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)参与调控。但是迄今为止,动脉粥样硬化的发生发展过程中ox-LDL对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖及成骨分化等生物学功能的影响及作用机制研究较少。因此,本研究试图揭示ox-LDL在BMSCs的增殖及成骨分化过程中的作用及其分子机理。为了证明ox-LDL对BMSCs的直接作用,我们用大鼠骨髓间充质干细胞(Rat bone marrow mesenchymal stem cells,rBMSCs)建立体外培养及其诱导分化体系。首先利用全骨髓贴壁法进行rBMSCs的分离纯化,并用流式细胞仪进行检测其表面标记蛋白CD73,CD90,CD106的表达,进而做了向成骨细胞、成脂细胞、成软骨细胞诱导分化实验,验证其多向分化的潜能。此基础上,我们混合ox-LDL和成骨诱导液对rBMSCs进行培养,并通过碱性磷酸酶活性和钙沉积情况进行成骨检测。结果发现ox-LDL促进rBMSCs的成骨分化,并具有添加剂量和作用时间依赖性。为了阐明ox-LDL促进rBMSCs的成骨分化的机制,我们进行转录组测序。结果显示NF-κB信号通路等20多个信号通路显著变化。相关研究报道及课题组前期实验结果显示,NF-κB信号通路在动脉粥样硬化发生发展中发挥重要作用。但是NF-κB信号通路在ox-LDL促进rBMSCs的成骨分化过程中的分子机制尚未得到充分的理解。因此为了阐明这个问题,我们聚焦于研究与NF-κB信号通路相关的三个补体NF-κB-p65,uPAR,C5aR的表达变化及其功能。荧光定量PCR和Western blot实验结果显示,BMSCs向成骨分化过程中,NF-κB-p65,uPAR,C5aR的表达显著上调,与RNA-seq测序结果一致。接下来我们添加C5aR补体特异性拮抗剂进行成骨诱导实验。结果发现,能显著抑制rBMSCs向成骨细胞分化能力。荧光定量PCR和Western blot实验结果显示,C5aR、uPAR、NF-κBp65的表达量均下调。然而,换用NF-κB-p65拮抗剂进行成骨诱导实验也得到了同样的结果。以上研究说明:NF-κB信号通路在BMSCs向成骨细胞分化的过程中发挥重要作用。近来多项研究报道显示,组蛋白修饰在MSCs成骨分化过程中也起着重要作用。因此,我们聚焦于组蛋白H3K27三甲基化修饰在成骨分化的rBMSCs基因组中的动态变化和作用。Western blot实验结果显示,rBMSCs向成骨分化过程中组蛋白去甲基化酶JMJD3表达显著上调,并且特异性地降低H3K27me3的甲基化水平。接下来用NF-κB和C5aR特异性拮抗剂干预处理细胞后发现,JMJD3表达显著下调,H3K27me3修饰水平明显升高。以上研究说明:NF-κB信号通路可以通过调控组蛋白去甲基化酶JMJD3的表达促进rBMSCs的成骨分化。我们的研究结果表明,在ox-LDL介导的高脂体外培养环境中,NF-κB-Jmjd3信号通路激活促进rBMSCs的成骨分化。
【学位授予单位】:内蒙古大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R329.2

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