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扁蓿豆MrDREB1转录因子调控下游基因的鉴定及其作用机制的初步研究

刘畅  
【摘要】:在复杂的逆境胁迫环境中,DREB(Dehydration Responsive Element Binding Protein)类转录因子发挥重要作用,目前的研究大多集中在对其功能的分析研究,而对其调控机制少见报道。DREB结合蛋白中第14位氨基酸(缬氨酸V)和第19位氨基酸(谷氨酸E)对于结合DRE/CRT元件非常关键,已有研究表明外源MrDREB1基因可以调控下游逆境胁迫应答基因MrCAS15A的表达,因此,预测MrDREB1通过与MrCAS15A启动子区域的DRE/CRT元件直接结合,调控其表达。本研究主要取得结果如下:1.提取生长4周的幼苗基因组DNA(Deoxyribonucleic Acid),通过PCR克隆得到大小为1266 bp的MrCAS15A的DNA序列,再利用扩增得到的基因组序列信息,运用Genome Walking技术扩增获得1968 bp MrCAS15A启动子片段。Plant CARE预测分析结果显示,该启动子序列中含有多个抗逆相关的功能元件,其中DRE元件(ATGTCGGTA)位于-(1643-1651)bp,该启动子中还包含与脱落酸、水杨酸等激素响应相关元件。2.酵母单杂交实验初步验证MrDREB1蛋白在真核细胞体内对MrCAS15A的转录激活,结果显示在SD/-Ura/-Leu/AbA双缺培养基上,pGADT7-MrDREB1-pAbAi-3×DRE酵母菌株生长单菌落,且长势与阳性对照基本一致,而pGADT7-MrDREB1-pAbAi-3×DRE mutant没有生长酵母单菌落,表明MrDREB1转录因子通过结合DRE顺式作用元件,来调控其下游报告基因MrCAS15A。3.为了进一步研究MrDREB1在扁蓿豆应对低温、干旱和高盐胁迫下是否也具有调控作用,本研究利用毛根转化法分别将超表达(Overexpression,OE)、tasiRNA干扰表达(tasi)的外源基因导入扁蓿豆幼苗根组织。选取长势基本一致的幼苗分别进行-8℃、300 mM Mannitol、200 mM NaCl非生物胁迫处理。处理后提取单株扁蓿豆根部总RNA,每个样品进行3个生物学重复。qRT-PCR结果显示,外源MrDREB1基因对MrERD10、MrCOR413基因的表达呈正调控作用,对MrP5CS、MrPP2C基因的表达呈负调控作用。我们检测了转基因扁蓿豆植株的生理生化指标,结果显示,MrDREB1降低了MDA的含量,提高了POD、SOD的酶活性和Pro的含量。综上所述,初步验证MrDREB1对MrCAS15A的调控过程是通过与DRE顺式作用元件特异性结合实现的,MrDREB1也对MrERD10、MrCOR413、MrP5CS、MrPP2C均有调控作用,超表达MrDREB1也可以提高扁蓿豆在逆境胁迫下的耐受能力。


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1 刘畅;扁蓿豆MrDREB1转录因子调控下游基因的鉴定及其作用机制的初步研究[D];内蒙古大学;2020年
2 张凤;扁蓿豆DREB转录因子家族同源基因MrDREB1的克隆和功能鉴定[D];内蒙古大学;2018年
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