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内蒙古肠道病毒分子流行病学及肠道病毒71型/轮状病毒联合疫苗研究

范耀春  
【摘要】:肠道病毒71型(Enterovirus,EV71)和轮状病毒(Rotavirus,RV)均是长期以来影响儿童健康的主要病原体,二者均为肠道病毒,传播途径主要为粪-口传播,易感人群均为5岁以下儿童。EV71是一种嗜神经病毒,常引起儿童发热、手足口病、疱疹性咽峡炎等临床症状,严重者可导致神经系统疾病和心脏病,甚至死亡。RV主要引起儿童病毒性腹泻,全球每年约有48~64万婴幼儿死于轮状病毒感染。为了控制以上两种病毒引起的传染病,从上世纪70~80年代,已开始研发针对两种病毒的预防性疫苗,到目前为止,已有3种EV71灭活疫苗和7种口服轮状病毒活疫苗上市。3种EV71灭活疫苗均产自中国,于2016年才上市,接种覆盖率相对较低,接种的数量比较有限,对该类疫苗的安全性和免疫持久性评价仍需一定时间。世界首款轮状病毒疫苗于1998年在美国上市,但因其与小儿严重不良反应肠套叠有较大关联性而被迫停止使用。从2000年中国上市轮状病毒活疫苗罗特威到现在,全球先后共上市了6种口服减毒的轮状病毒疫苗。但由于轮状病毒疫苗在中国尚未纳入国家免疫规划范畴,属自愿自费接种的二类疫苗,因此接种的人群仍然有限。目前,对现有轮状病毒活疫苗是否可再次引起小儿肠套叠等严重不良反应还不能定论。鉴于上述情况,亟需开发新的EV71疫苗和RV疫苗,以避免出现现有疫苗发生重大副作用而无法使用的空窗问题,本课题针对EV71和RV两种病毒的诸多相似之处,通过嵌合重组蛋白表达技术,探索研究一种新型的EV71/RV联合疫苗,通过一系列免疫学实验,取得了预期成果。本研究主要研究内容和方法1.内蒙古地区主要肠道病毒分子流行病学特征分析。通过流行病学调查方法和病原微生物实验室检测技术,监测并分析了内蒙古地区2014~2018年5年间手足口病发病情况和EV71病毒的流行病学特征;基于内蒙古最大的儿童医院-内蒙古妇幼保健院、综合性医院-内蒙古人民医院和内蒙古医科大学附属第一医院、部队医院-武警内蒙古总队医院、县级综合医院-内蒙古托克托县医院开展5岁以下儿童病毒性腹泻的调查和病原的检测,分析轮状病毒流行特征;通过现场采样、实地调查和实验室检测,在内蒙古所有地市开展了5岁以下健康儿童携带肠道病毒情况,分析了健康儿童携带肠道病原特征。2.小鼠动物模型建立。通过连续传代,培养EV71和RV的小鼠适应株,利用小鼠适应毒株,构建两种病毒的动物模型。3.细胞免疫学机制研究。通过小鼠适应株EV71 C33λ转染Vero细胞,探索细胞水平上的免疫学机制。4.重组联合疫苗的构建和免疫学性质研究。基于轮状病毒高度保守的组抗原蛋白VP6,成功构建了携带vp6基因的表达载体,从EV71主要抗原蛋白VP1和VP2上分别筛选出一个抗原性较强的表位SP70和SP28,插入VP6内部构建并表达基于VP6的两个嵌合重组蛋白VP6/SP70和VP6/SP28。两个重组蛋白作为联合疫苗免疫动物后,通过ELISA、中和试验、动物保护实验等方法进行验证。本研究研究结果和结论1.掌握了内蒙古2014~2018年期间手足口病发病特征,5年间共报告手足口病病例70,601例,年平均发病率达56.48/10万。实验室诊断病例6561例,其中EV71检出率为32.57%,占引起手足口病所有病原体的第一位,主要流行于6~7月。5岁及以下儿童发病最多,5年间共报告59,890例,占总发病数的84.83%。通过分子进化分析,内蒙古流行的EV71全部为C4亚型,与国内株同源。2.通过4家大型医院和1家县级医院的患者病毒分子流行病学特征的分析,发现轮状病毒为引起5岁以下儿童的最主要病原,占比达30.76%,主要集中在较寒冷季节,11月~次年2月期间发病数占59.22%。分析了内蒙古地区RV毒株的血清型(G型)和基因型(P型),共检出5种G型,其中G9型为主要流行血清型,占82.55%;4种P型,P[8]型为主要流行基因型,占88.04%。3.内蒙古地区5岁以下健康儿童的肠道病毒携带率达7.50%,共检出5种肠道病毒,包括EV71病毒、柯萨奇病毒和埃可病毒。4.获得了EV71和RV的小鼠适应株,多次传代后的EV71和RV毒株可感染小鼠,表现出典型的临床症状。利用昆明小鼠,构建成功了EV71和RV两种病毒的动物模型。5.细胞免疫学机制研究结果发现,在EV71感染的Vero细胞中能检测到免疫相关因子基因表达水平的上调。6.成功构建了基于RV VP6蛋白的嵌合蛋白表达载体,获得了VP6/SP70和VP6/SP28两个重组蛋白。经过检测,重组蛋白具有较强的免疫原性,在免疫小鼠获得的抗血清中能检测到EV71和RV VP6的特异性Ig G抗体;获得的抗血清可有效中和EV71病毒,中和抗体滴度达1:64~1:128。两个重组蛋白也具有较强的刺激细胞免疫能力,免疫后的小鼠体内可检测到IFN-γ、CD4、CD8和IL-1β四种免疫因子表达的上调。在小鼠体内口服和肌肉注射两种接种途径效果相当。氢氧化铝佐剂可有效增强本研究中重组联合疫苗的效果。重组联合疫苗可有效抵抗EV71和RV两种病毒的感染,保护水平较高。


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