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非小细胞肺癌中LPA受体亚型的靶向作用及其机制研究

吴双  
【摘要】:溶血磷脂酸(LPA)作为一种生物活性脂质小分子,通过其6种受体亚型(LPAR1-6)偶联G蛋白介导多种信号通路,参与多种生理病理过程。研究报道LPA在人卵巢癌腹水和人肺癌胸腔积液中大量积累,其中LPA被认为是卵巢癌的生物标记,而我们在研究中发现LPA促进肺肿瘤的发展。因此,本研究将探究参与LPA在非小细胞肺癌中靶向作用的受体亚型,在细胞、组织及个体三个层面上阐明其信号机制,同时对LPA介导的受体亚型能否成为肺癌治疗的小分子靶点做机制性探讨。研究中以非小细胞肺癌A549细胞株作为细胞模型,分别用CCK法、transwell小室、克隆形成实验检测LPA对A549细胞的作用,分别采用药理学和分子生物学方法检测LPA受体亚型在LPA诱导细胞增殖迁移过程中的作用;克隆人LPAR1和LPAR3基因,构建LPAR1/3基因的过表达载体,构建LPAR1基因干扰载体。在此基础上构建LPAR1/3过表达细胞系和LPAR1干扰细胞系,通过荧光定量PCR法检测基因表达水平,用western blot方法检测目的蛋白表达,通过ELISA法测定细胞内c AMP的含量。免疫组化检测分析癌旁组织和肺癌组织中溶血磷脂酸受体的表达并做H-score评分。利用人源肺癌细胞A549的裸鼠异种移植肿瘤模型,评估体内溶血磷脂酸受体的体内致瘤性。在LPA受体转基因细胞模型中阐明LPA诱导作用的信号转导机制。研究发现LPA促进肺癌细胞的增殖、迁移及克隆形成。溶血磷脂酸受体1和3亚型在A549细胞中优先表达;LPAR1/3受体拮抗剂Ki16425和LPAR1受体拮抗剂Ono7300243均能抑制LPA诱导的细胞增殖迁移活性。LPAR1过表达可以促进A549细胞增殖和迁移,而LPAR3在细胞中过表达没有此作用;LPAR1敲低会降低LPA诱导的细胞增殖和迁移活性。在免疫组化实验中观察到肺癌组织的LPAR1表达明显高于癌旁组织。裸鼠异种移植肿瘤模型中LPAR1稳定过表达的A549细胞来源肿瘤块质量和体积均显著高于对照组,同时,LPAR1敲低A549细胞源的异种移植裸鼠肿瘤块质量和体积均显著降低。在裸鼠肿瘤块中,LPAR1和Ki-67在LPAR1过表达细胞源固体肿瘤中显著高表达并且两者之间呈现正相关性。研究结果显示,Gi蛋白抑制剂PTX能显著抑制LPA诱导的A549细胞增殖迁移作用。STS作为PKC的抑制剂也能抑制LPA诱导的A549细胞迁移作用,而H89(PKA的抑制剂)没有明显作用。LPA在LPAR1过表达A549肺癌细胞中激活ERK1/2、JNK和p38的磷酸化。PD98059(ERK1/2的抑制剂)显著抑制LPA诱导的A549细胞增殖作用,SB203580(p38的抑制剂)显著抑制LPA诱导的A549细胞迁移作用,但是,SP600125(JNK的抑制剂)对LPA诱导的A549细胞增殖和迁移过程中几乎没有作用。NF-?B抑制剂BAY11-7082能够同时抑制LPA/LPAR1介导的A549细胞增殖和迁移作用综上所述我们得出以下结论:1.在人肺癌A549细胞中LPAR1和LPAR3优先表达,LPAR1促进LPA诱导的肺癌细胞增殖迁移和克隆形成作用,但LPAR3不参与此过程。LPAR1在肺癌组织中高表达,可作为一种潜在的分子标记物。2.LPAR1在体内具有致瘤性。3.LPAR1促进肺癌A549细胞增殖的信号通路为LPA/LPAR1/Gi/ERK1/2/NF-?B,而其促进迁移的通路为LPA/LPAR1/Gi/PKC/JNK-p38/NF-?B。我们的研究结果表明,LPAR1可能是肺癌的一个潜在治疗靶点,而LPAR1拮抗剂则有望成为肺癌治疗的候选药物。


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