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光活性探针识别microRNA调控网络中致癌靶标基因的研究

苏治宇  
【摘要】:micro RNA(miRNA)是一类内源性非编码RNA,以亲和互补方式作用于靶标基因m RNA,并参与至各自调控网络中,从而调控多种多样生理和病理过程。miRNA-m RNA相互作用,关乎miRNA具体生命功能的实现,其精准识别与否,亦为探究该对应功能的先决条件。光交联-免疫共沉淀法(CLIP)实为有效识别miRNA靶基因的手段,较之程序测算颇为可信,但该方法操作过程冗杂、繁琐,因此亟需更为简单、便捷的化学生物学手段,准确、高效地识别miRNA靶基因。【研究目的】本论文旨在设计和制备一种基于光反应性寡核苷酸的、高效的miRNA探针,检测该探针识别miRNA靶标的效率及其与靶m RNA的反应活性,评估其快速简便的确定miRNA靶标可行性。本文设计合成psoralen修饰的miRNA反义核酸探针(miR探针),该探针兼具光反应性及生物活性,在UVA(波长360 nm)下则可与互补链发生交联反应,且细胞内外均可进行。miR探针亲和于调控网络中靶标基因,光反应后二者以共价交联形式存在,在m RNA层面分析靶标基因表达水平时,受miRNA-m RNA共价键影响,反转录产物可少于野生型miRNA所识别的靶基因产物。结合高通量RNA-seq测序手段,其miRNA-m RNA共价交联所得c DNA文库加以分析、筛选,从而实现仅以m RNA层面入手即可快速、高效识别miRNA调控网络中靶标基因的目标。【研究方法】(1)miR探针的化学合成:通过化学合成的方法,制备NHS活性化的psoralen衍生物,并将其与在种子序列(seed sequence)内特定位点上嫁接自由氨基的miRNA-29a和miRNA-34a分别反应,采用变性PAGE凝胶电泳的方法,对探针产物miR-29a-ps、miR-34a-ps进行分析和表征。(2)miR探针的细胞外活性检测:在试管内将miR探针和具有互补序列的一段寡核苷酸退火后,在UVA(360 nm)光照下进行交联反应,采用变性PAGE凝胶电泳的方法分析交联产物,评估并确认miR探针光反应性。(3)miR探针的细胞内活性检测:分别采用光活性探针miR-29a-ps和miR-34a-ps转染A549细胞后,采用RT-q PCR定量分析细胞中已报道的miR-29a、miR-34a靶基因的m RNA含量差异,从而评估miR探针的细胞内生物活性。(4)miR探针的靶标识别方法的确立:分别采用光活性探针miR-29a-ps和miR-34a-ps转染A549细胞后,在不同时间点对活细胞进行UVA光照处理,而后提取细胞中poly(A)RNA,利用RNA-seq技术分析并分别筛选各miRNA候选靶标基因。(5)miR-29a-ps探针靶标识别效率的测评:结合RNA-seq分析结果,采用RTq PCR手段进一步筛选miR-29a靶标基因,并采用分子克隆技术构建含有候选靶标基因3′UTR序列的萤火虫荧光素酶报告基因的载体,进而以Dual Luciferase报告基因检测手段,验证miR-29a及候选靶m RNA间相互作用位置;最后采用Western Blotting Assay技术确定miR-29a的靶标基因。(6)miR-34a-ps探针靶标识别效率的测评:同miR-29a靶基因筛选过程,经RT-q PCR、Dual Luciferase报告基因检测、Western Blotting等分子生物学手段确认miR-34a的靶标基因,评价光活性基团修饰的不同家族miR探针识别靶标基因的效率。【研究结果】(1)变性PAGE凝胶电泳分析表明psoralen修饰的两种miR探针的合成是成功的。其中,甲基化psoralen修饰的miR探针(miR-29a-ps)与互补序列的光交联产物,在变性PAGE胶中出现单一条带,说明该探针的光反应性较高。RT-q PCR分析表明,在转染miR-29a-ps、miR-34a-ps的A549细胞中,已被广泛报道的相应靶m RNA水平呈现不同程度的下调,证明探针具有生物活性。(2)转染miR探针的细胞,经UVA(360 nm)光交联处理后,提取细胞中总m RNA进行RNA-seq分析,对比参考序列,分析mi Ctrl vs miR-ps处理组结果,选取log2(fold change)-0.2、-log10(p-value)0.4且FPKM100的差异基因为候选靶标基因。最终miR-29a对应27个所选定的候选靶基因,miR-34a则对应34个靶基因。(3)进一步确认miR-29a靶基因结果表明,在27个候选基因中10个基因呈显著性下调表达。经Dual Luciferase Assay分析miR-29a与这10个基因非编码区直接相互作用,以及经Western Blotting在蛋白水平上分析候选基因蛋白表达差异,最终确认了miR-29a的两个新靶标基因(PTTG1和PTGR1)。进一步采用motif测算程序及Dual Luciferase检测实验,确定了miR-29a作用于PTTG1和PTGR1 m RNA的作用位置。(4)针对miR-34a的靶基因确认表明,在34个候选基因中有10个表达降低的基因;经Dual Luciferase Assay、Western Blotting分析后确认了一个新的靶标(ILF2)。同时,motif测算程序及Dual Luciferase检测实验也证明miR-34a直接作用于ILF2 m RNA的3′端非编码区。【研究结论】(1)甲基化psoralen修饰的miR探针的合成方法简单,产率高,产物纯度高且具有良好的光反应性;miR探针在细胞外、细胞内均有光反应性和生物活性,适合活细胞内基因表达分析;(2)结合miR探针和RNA-seq的方法,能够在活细胞内确定miRNA的靶基因,操作简便易行,效率较高,适合具有不同碱基序列的miRNA探针的设计和应用;(3)非小细胞肺癌细胞中,首次确认了miR-29a的两个靶基因(PTTG1和PTGR1),miR-34a的一个靶基因(ILF2),为揭示上述miRNA在肺癌发病机制中所扮演的调控角色提供了基础。


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