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miR-532-5p调控C2C12成肌细胞分化的作用机制研究

陶金  
【摘要】:骨骼肌是人体的重要组织,在维持机体运动、能量代谢调节等方面具有关键作用。近年研究发现miRNA在骨骼肌细胞分化过程中发挥重要作用。其中miR-532-5p在调控心肌细胞凋亡和成骨细胞分化中发挥作用,但其在骨骼肌细胞分化过程中的功能和机制尚不明确。本研究对小鼠成肌细胞C2C12进行成肌诱导分化,随后通过miR-532-5p的过表达及其靶基因的敲减探究miR-532-5p对C2C12细胞成肌分化的影响,并探讨miR-532-5p影响成肌细胞分化的作用机制。1、优化C2C12细胞成肌分化条件为优化C2C12细胞成肌条件,本研究将不同数目的C2C12细胞接种到含不同浓度马血清的培养液中,结果发现,将5.00×10~4个C2C12细胞接种到含2%马血清的培养液中为最佳成肌分化条件。2、miR-532-5p在C2C12细胞成肌分化过程以及小鼠不同组织中表达变化收集分化3天、5天和7天的细胞样品,进行实时定量PCR检测,结果发现,miR-532-5p随着C2C12细胞分化时间的增加,其表达量逐渐下降;取小鼠不同组织,进行实时定量PCR检测,结果发现,miR-532-5p在小鼠脂肪中表达量最高,其次是心脏和肌肉。3、miR-532-5p过表达对C2C12细胞成肌分化的影响在C2C12细胞中转染miR-532-5p mimics,随后对分化3天、5天和7天的肌管进行吉姆萨染色和免疫荧光染色,统计肌管长度、直径和融合率。结果发现,肌管长度及融合率均显著下降。利用实时定量PCR和Western Blot检测成肌标志性基因在分化3天、5天和7天表达情况,结果发现成肌标志性基因Myod、Myog和Myf5在转录及蛋白水平表达量均显著下调。说明miR-532-5p过表达抑制C2C12细胞的成肌分化。4、筛选并验证靶基因为探究miR-532-5p调控成肌细胞分化的作用机制,我们通过靶基因预测网站以及各基因的评分,最终筛选出6个miR-532-5p的候选靶基因。双荧光素酶验证试验发现Frs2是miR-532-5p的靶基因。利用实时定量PCR和Western Blot检测过表达miR-532-5p后Frs2的表达变化,结果发现Frs2转录及蛋白水平均显著下降。进一步证实了Frs2是miR-532-5p的靶基因。5、Frs2敲减载体对C2C12细胞成肌分化的影响利用实时定量PCR检测Frs2在C2C12细胞分化3天、5天和7天时表达量变化以及其在小鼠不同组织中表达情况,结果发现Frs2在成肌分化过程中呈上升趋势;其在小鼠脂肪中表达量最低、其次是胃和肌肉。将Frs2敲减后转入C2C12细胞,对诱导分化3天、5天和7天的肌管进行吉姆萨染色和免疫荧光染色,统计肌管长度、直径和融合率。结果发现,肌管长度及融合率显著下降。随后利用实时定量PCR和Western Blot检测成肌标志性基因的表达情况,结果发现Myod、Myog和Myf5转录及蛋白水平表达量均显著下降。上述结果表明Frs2的敲减抑制C2C12细胞的成肌分化,与miR-532-5p过表达效果基本一致。综上所述,miR-532-5p通过调控靶基因Frs2影响Myod、Myog和Myf5的表达,进而调控C2C12细胞成肌分化。这些研究结果为肌肉分化机理的探索及疾病的诊断和治疗提供了实验依据。


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