收藏本站
《内蒙古大学》 2004年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

用绿色荧光蛋白和肝再生增强因子基因进行转基因绵羊胚胎的研究

马玉珍  
【摘要】:本文在制备人肝再生增强因子转基因绵羊的上游工程中,利用绿色荧光蛋白作为选择标记,通过体细胞核移植技术建立细胞、胚胎水平上的转基因阳性筛选体系。该体系的建立在生产转基因绵羊的过程中可减少代孕母畜数量,降低成本,提高转基因效率。 1.绿色荧光蛋白和人肝再生增强因子基因真核表达载体的构建 利用分子生物学技术分别从人和绵羊基因组DNA中克隆了人肝再生增强因子(Human of liver regeneration, ALR)基因组DNA和绵羊β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,BLG)基因5’端0.8kb DNA序列,从pEGFP-C1质粒中克隆了增强绿色荧光蛋白(Enhance green fluorescent protein, EGFP)基因及其表达调控元件,构建了以下三种真核表达载体:(1)ALR基因乳腺特异表达,EGFP基因非组织特异性表达载体,pGEM-BAE。(2)ALR和EGFP基因双顺反子表达载体,pIRES-EGFP/ALR。(3)ALR和EGFP融合基因表达载体,pEGFP/ALR。经PCR和酶切检测,证明载体构建正确,为下一步转基因绵羊的研究奠定了基础。 2.绵羊胎儿成纤维细胞的分离培养及转基因条件的优化 取6个30天左右的绵羊胎儿,从中成功分离、培养了绵羊胎儿成纤维细胞(sheep fetal fibroblast cells, sFFCs)。测定了sFFCs的G418敏感浓度,sFFCs的G418筛选浓度为800ug/ml,维持浓度300ug/ml。另外分别优化了两种转染试剂LipofectAMINE~(TM)和Fegene-6转染sFFCs的条件,比较了DNA纯度、浓度、转染试剂用量及细胞暴露于DNA、转染试剂中作用时间对转染效率的影响,LipofectAMINE~(TM)转染sFFCs较为适宜的条件是,LipofectAMINE~(TM)10ul, DNA 2ug, 马玉珍用绿色荧光蛋白和肝再生增强因子基因进行转基因绵羊胚胎的研究 共作用时间shr,转染效率为每视野42个荧光细胞,Fegene一6转染SFFCs较为 适宜的条件,Fegene一6 6ul,DNA Zug,共作用时间12hr。转染效率为每视野 19个荧光细胞。转染结果表明:对于绵羊胎儿成纤维细胞,LipofectAM工NE丁“转 染效率较好,为目的基因转染SFFCS提供了参考依据。 3.绿色荧光蛋白对绵羊胎儿成纤维细胞生物学特性的影响及绵羊胎儿成纤 维细胞性别鉴定 LipofeetAMINETM介导pEGFP一Cz转染体外培养的6只绵羊胎儿SFFCS,经G418 筛选12天,挑选发绿色荧光的单克隆细胞扩大培养23天(转基因后共培养35 天),进行细胞形态观察、生长曲线以及染色体核型分析。结果表明,整合有EGFP 基因的SFFCS与对照组细胞比较,在细胞形态、生长曲线、染色体正确核型率 上无明显差别。同时利用PCR方法对体外培养的6只绵羊胎儿的SFFCS进行性 别决定区(seX determining region of、hey,sRY)基因检测,以明确SFFCs 性别。结果显示:6只绵羊胎儿成纤维细胞中,其中2只为雌性胎儿细胞、4只 为雄性胎儿细胞,对SRY基因的分析与染色体分析结果一致,明确了sFFCS的 性别,可通过体细胞核移植进行己知性别的转基因克隆绵羊的研究。 4.绿色荧光蛋白和肝再生增强因子融合基因在绵羊胎儿成纤维细胞中的表达 利用LipofectAMINE,加介导线性化pEGFP/ALR质粒转染SFFCS。经G418筛 选,10d后共形成38个单克隆细胞,其中23个克隆发荧光,15个克隆不发荧 光。挑选3个荧光细胞克隆和3个不发荧光的细胞克隆扩大培养,用PCR、聚丙 烯酸胺凝胶电泳及免疫组化检测。结果表明:3个荧光单克隆细胞均有ALR、Neor 基因的PCR产物,聚丙烯酞胺凝胶电泳可见57KD大小的融合蛋白,免疫组化检 测到ALR蛋白分布于SFFCS胞质和胞核,且胞核含量多于胞质;3个非荧光单克 内蒙古大学博士学位论文 隆细胞中不仅有ALR、EGFP、Neor基因PCR条带,而且其中的1个克隆还有融合 蛋白。荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白在sFFCS中的分布与ALR分布一致。 由此可见,ALR、EGFP融合基因能够在SFFCS中表达,通过绿色荧光可确定ALR 在细胞内的表达部位。 5 .EGPP和ALR双顺反子表达载体转染绵羊胎儿成纤维细胞及体细胞克隆产 生转基因囊胚 以Lipofe。tAMINE仪介导线性化pIRES一EGFP/ALR质粒转染sFFCs,经G418 筛选,12天后形成43个细胞单克隆,其中发荧光的27个。挑选其中的3个荧 光细胞单克隆进一步扩大培养,分别进行PCR、RT一PCR及免疫组化检测。结果 表明:ALR基因在荧光单克隆细胞中存在并表达,而且与EGFP同时表达。取其 中1株荧光单克隆细胞饥饿培养,进行绵羊的体细胞核移植,结果显示:对146 个卵母细胞进行核移植,得到45个8细胞期胚胎,其中14个发育到囊胚阶段, 激光共聚焦显微镜下观察囊胚中的每个细胞均发出绿色荧光,并检测到囊胚中 有ALR蛋白的表达。由此说明EGFP、ALR在细胞和胚胎水平上同时表达。建立 了一套胚胎移植前高效的体细胞核移植筛选系统。 6.原核显微注射法制备转基因绵羊胚胎 本研究利用原核显微注射法将线性化的pGEM一BAE DNA注射于182枚绵羊受 精卵原核中,体外发育培养48hr,荧光显微镜下观察,可见5枚荧光胚胎,表 明所构建载体中 EGFP能够作为标记基因进行转基因阳性胚胎筛选,为进一步生 产乳腺特异性表达ALR的转基因
【学位授予单位】:内蒙古大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:Q789

手机知网App
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 安晓力;;澳加紧绵羊肉蝇蛆病防治的研究[J];全球科技经济瞭望;1986年04期
2 多尼金;陈璞;;墨西哥的查姆拉人[J];世界知识;1981年03期
3 张学舜;何学谦;黄怀昭;周乃祥;佘陆君;肖开进;陶群芬;;绵羊血清氨基酸含量昼夜节律的测定和研究[J];西南民族大学学报(自然科学版);1989年04期
4 银巍;绵羊的克隆[J];医学与哲学;1997年06期
5 勤实;;克隆绵羊“多利”是未老先衰吗[J];北京工人;1999年12期
6 段国芳,王兰玉,陶玉莲,张生福;乐都县岗沟镇绵羊唾液中钠、钾含量的检测[J];青海大学学报(自然科学版);2002年03期
7 ; 动态点击[J];科学24小时;2002年01期
8 刘海军,薛俊,徐直,张冬梅,李义海;绵羊卵巢腔前卵泡的分离与体外培养[J];华北农学报;2004年02期
9 陈裕祥,普布次仁,尼玛,庄银正,普穷,贡嘎桑布;不同含量尿素对绵羊增重影响及毒性试验观察研究报告[J];西藏科技;2005年01期
10 李岩,闫江林,李静,张力,张鲁安,贾斌;新疆绵羊棘球蚴病流行情况调查分析[J];石河子大学学报(自然科学版);2005年01期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 邓卫东;席冬梅;杨舒黎;苟潇;毛华明;;乌骨绵羊的发现和生理及遗传特征[A];全国动物生理生化第十次学术交流会论文摘要汇编[C];2008年
2 刘洁;秦秀慧;黄莉;童丰;李军;宋建平;马李颖;;胰岛素喷鼻液浓度与剂量对正常绵羊鼻粘膜吸收的影响[A];中国畜牧兽医学会兽医病理学分第12次暨中国动物病理生理学专业委员会第11次学术讨论会论文集[C];2003年
3 沈向真;陈杰;;不同摄食量对氨基酸在绵羊后肢转运的影响[A];动物生理生化学分会第八次学术会议暨全国反刍动物营养生理生化第三次学术研讨会论文摘要汇编[C];2004年
4 库尔班·吐拉克;雒秋江;杨开伦;潘榕;陈勇;卡哈尔·买买提;;添加淀粉对饲喂玉米秸秆绵羊采食与消化代谢的影响[A];中国畜牧兽医学会动物营养学分会——第九届学术研讨会论文集[C];2004年
5 杜荣;秦健;安晓荣;陈永福;;绵羊Myostatin基因打靶载体的构建[A];全国动物生理生化第十次学术交流会论文摘要汇编[C];2008年
6 孙洪新;刘月琴;张英杰;;绵羊抗菌肽研究进展[A];全国养羊生产与学术研讨会议论文集(2007-2008)[C];2008年
7 王忻;刘月琴;张英杰;;褪黑激素受体对绵羊季节性繁殖的调控[A];全国养羊生产与学术研讨会议论文集(2007-2008)[C];2008年
8 陈晓霞;翟博;刘磊;秦霞;黄英俏;杨连玉;;刺五加对绵羊瘤胃发酵及养分利用的影响[A];中国畜牧兽医学会2009学术年会论文集(下册)[C];2009年
9 王洪荣;卢德勋;;饲喂玉米型日粮的生长绵羊限制性氨基酸研究[A];第三届全国饲料营养学术研讨会论文集[C];1998年
10 史清河;冯仰廉;莫放;;绵羊小肠液冻干粉用于瘤胃非降解精饲料残渣的粗蛋白质消化率测定的研究[A];中国畜牧兽医学会动物营养学分会第六届全国会员代表大会暨第八届学术研讨会论文集(下)[C];2000年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 王学会 刘亚楠;河北盐渍绵羊肠衣首次出口巴西[N];中国国门时报;2010年
2 匡远深;北京天坛医院成功建立绵羊AVM模型[N];中国医药报;2002年
3 记者 何琼香;最贵绵羊一万一只[N];昆明日报;2010年
4 李燕蓉;“绵羊”商标的保护范围有多大[N];厂长经理日报;2000年
5 ;谁之过[N];光明日报;2000年
6 ;新中国60年百项科技第一[N];大众科技报;2009年
7 郑延平;绵羊“修身”可养生[N];山东科技报;2007年
8 记者 丁耘;云南保护乌骨绵羊初显效[N];新华每日电讯;2009年
9 陈晓明;关注新生代留学[N];人民日报;2002年
10 郑延平;绵羊的几项“修身”[N];云南科技报;2006年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 马玉珍;用绿色荧光蛋白和肝再生增强因子基因进行转基因绵羊胚胎的研究[D];内蒙古大学;2004年
2 赵锡安;白细胞介素6及其受体在绵羊早期胚胎中的表达和作用研究[D];内蒙古大学;2011年
3 张戈;绵羊DSG4基因的结构、遗传多样性、系统发育及重组特性[D];中国农业科学院;2011年
4 肖朝庭;影响绵羊高繁殖力和非季节性发情基因的研究[D];浙江大学;2007年
5 赵凤;绵羊甘露糖结合凝集素基因(MBL)与支原体肺炎的相关性研究[D];石河子大学;2011年
6 韩卫杰;绵羊脂肪组织中致膻物质及其形成机理的初步研究[D];西北农林科技大学;2010年
7 曾献存;新疆绵羊遗传多样性及主要经济性状候选基因研究[D];石河子大学;2010年
8 张东;转fat-1基因体细胞克隆绵羊的研究[D];内蒙古农业大学;2011年
9 王岗;绵羊小肠寡肽吸收规律的研究[D];内蒙古农业大学;2001年
10 赵丽霞;克隆绵羊印记相关基因的DNA甲基化研究[D];内蒙古农业大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 永荣;乌审旗地区绵羊蠕虫病流行病学调查及驱虫效果比较研究[D];内蒙古农业大学;2010年
2 亓美玉;绵羊超数排卵技术研究[D];东北农业大学;2004年
3 孙博;伊维菌素脂质体的制备及其对药物在绵羊体内分布的影响[D];中国农业大学;2003年
4 夏冬华;秸秆专用添加剂与制粒对绵羊利用玉米秸秆日粮的影响[D];新疆农业大学;2004年
5 刘春龙;丝兰属植物提取物对绵羊瘤胃发酵及饲粮养分消化的影响[D];东北农业大学;2004年
6 闫景娟;中国新疆八个绵羊群体微卫星DNA的遗传多样性研究[D];内蒙古农业大学;2004年
7 魏敏;棉花秸杆对绵羊饲用价值的初步研究[D];新疆农业大学;2002年
8 刘晓敏;6个绵羊类群Callipyge和CAPN1基因多态性及其与生长性状的相关性研究[D];甘肃农业大学;2010年
9 唐彦君;丝兰属植物提取物对绵羊饲料氮代谢影响的研究[D];东北农业大学;2004年
10 李慧全;不同处理的鲁梅克斯K-1杂交酸模对绵羊、家兔饲喂价值的研究[D];新疆农业大学;2000年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026