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《内蒙古大学》 2009年
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转过表达和低表达胰岛素样生长因子Ⅰ基因牛成纤维细胞系的制备

杨美玲  
【摘要】: 胰岛素样生长因子I(Insulin-like Growth Factor-I,IGF-I)在哺乳动物胚胎发育中起着非常重要的作用。研究表明适当浓度的IGF-I能够提高体外培养的卵母细胞的成熟率,并通过抗凋亡作用提高体外胚胎的存活率,增加囊胚内细胞数目。但其作用机理还知之甚少。转基因动物和基因干扰技术作为研究基因功能的重要手段,可以用来探究基因在牛胚胎发育过程中的作用机理。为了阐明IGF-I在体外牛胚胎发育过程中的功能,本研究利用转基因技术,用脂质体和电击法将过表达载体pIRES2-EGFP-IGF1和干扰载体pGCsi-IGF1导入牛胎儿成纤维细胞中,筛选得到稳定表达细胞株,为建立过表达IGF-I和低表达IGF-I的胚胎提供核供体,为进一步通过构建转基因胚胎模型来探究IGF-I在体外牛胚胎发育过程中的机理奠定了基础。 1.过表达载体pIRES2-EGFP-IGF1和干扰载体pGCsi-IGF1的构建 (1)通过RT-PCR方法从牛肝脏总RNA中扩增胰岛素样生长因子I(IGF-I)编码区cDNA序列,以T载体pMD19-T为克隆骨架构建中间克隆载体pMD19-T-IGF1。将IGF-I片段连接在双顺反子载体pIRES2-EGFP的BglⅡ+SalⅠ位点,构建过表达载体pIRES2-EGFP-IGF1。限制性内切酶分析以及对测序结果表明,本研究所构建的的过表达载体pIRES2-EGFP-IGF1结构与序列均与预期设计相符合。 (2)针对牛IGF-I基因的第594-622bp区域5'-GGCTCAGAAGGAAGTACAT-3'设计了一条发夹式RNA干扰片段,连接在干扰载体pGCsilencer-RFP上,构建了干扰载体pGCsi-IGF1。 2.牛胎儿成纤维细胞的分离与体外培养 通过组织块贴附法成功分离出牛胎儿成纤维细胞,利用DMEM+10%FBS培养液在37℃、5%CO_2、饱和湿度条件下体外培养和传代,各代成纤维细胞在DMEM+20%FBS+10%DMSO培养液中冷冻保存;同时详细记录牛胎儿成纤维细胞的形态和生长特性,绘制了第5和10代牛胎儿成纤维细胞的生长曲线,并制作和分析了第5代细胞中期染色体的数目。通过以上分析证明,分离和培养的牛胎儿成纤维细胞在体外培养环境下,随代次增加,生长速度渐缓;第五代染色体数目正常(2n=60),可以用第五代前的细胞进行转染实验。同时检测了牛胎儿成纤维细胞对筛选药物G418和潮霉素的耐受性,浓度稀释梯度实验结果确定G418的最佳筛选浓度为800μg/ml,潮霉素最佳筛选浓度为50μg/ml。 3.牛胎儿成纤维细胞的外源基因转染以及转基因克隆细胞的筛选和鉴定 用脂质体法和电击法转染牛胎儿成纤维细胞,48小时后分析转染效果并进行筛选。利用实时定量PCR技术检测了转染48小时后载体的表达效率,与对照组细胞相比发现,转染过表达载体pIRES2-EGFP-IGF1的细胞中IGF-I表达量显著升高,约是对照组的40倍(P<0.05),转染干扰载体pGCsi-IGF1的细胞中IGF-I表达量则显著降低,约是对照组的0.023倍(P<0.05),表明构建的2个载体具有正常的功能,可以进行下一步的筛选。转染48小时后以800μg/ml G418和50μg/ml潮霉素为抗性筛选浓度,在DMEM+10%FBS培养液在37℃、5%CO_2、饱和湿度条件下连续培养10-12天,分别获得了表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的转基因克隆细胞。通过对转基因细胞基因组DNA的PCR扩增,证实外源基因已稳定整合在转基因细胞基因组中,可以用做核移植的核供体细胞,制备转基因胚胎模型,为进一步研究IGF-I在体外牛胚胎发育过程中的机理奠定了基础。
【学位授予单位】:内蒙古大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:Q78

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【引证文献】
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1 王瑞;牛胚胎干细胞培养条件以及差异表达基因的研究[D];内蒙古大学;2012年
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1 靳木子;牛胚胎干细胞技术研究[D];内蒙古大学;2010年
【参考文献】
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1 李威;张清兰;吕艳欣;严云勤;;胰岛素样生长因子(IGFs)及其在早期胚胎发育中的作用[J];东北农业大学学报;2007年01期
2 王海晶;杨和平;周向东;;RNA干扰CA916798基因真核表达载体的构建与鉴定[J];第三军医大学学报;2008年01期
3 杨东山;杜晨光;高飞;旭日干;;牛胎儿成纤维细胞的组织块贴附法分离培养与电穿孔法基因转染[J];动物学研究;2006年01期
4 李新萍,ms.qdio.ac.cn,秦松,曾呈奎;孤雌生殖海带对氯霉素和潮霉素的敏感性研究[J];海洋与湖沼;1999年02期
5 高玉红;李庆章;;胰岛素样生长因子系统研究进展[J];中国乳品工业;2006年04期
6 张海宁,侯筱魁,杨冠珍,吴祥甫,吴小燕;人IGF-I基因真核表达质粒pIRES2-EGFP-IGF-I的构建[J];上海第二医科大学学报;2004年05期
7 张梅英;李华;董婉维;杨葳;秦英;汪瑛;周生来;于洋;王惟;王太一;王禄增;;具有潮霉素B抗性的NIH3T3细胞饲养层的制备[J];实验动物与比较医学;2005年03期
8 来大志,翁少洁,齐连权,于长明,付玲,于婷,陈薇;通过高表达Igf1/Bcl-2或Bcl-2/Cyclin E基因组合使CHO细胞适于在无蛋白培养基中抗凋亡培养[J];生物工程学报;2004年01期
9 王元元;董万利;胡锦;;RNA干扰抑制胰岛素样生长因子-1表达并诱导胶质瘤细胞凋亡[J];上海医学;2006年08期
10 陈冰,刘晓辉;胰岛素样生长因子结合蛋白功能及其调节机制[J];生命的化学;2001年05期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 王萍;顾海风;李信书;;海带成熟孢子体对两种抗性筛选标记敏感性的研究[J];安徽农学通报;2007年18期
2 王轶敏;王新庄;李金辉;李义书;冯勋伟;;不同培养系统和传代方法对昆明白小鼠原始生殖细胞分离培养的影响[J];安徽农业科学;2008年12期
3 杨素芳;崔奎青;陈华海;韦精卫;韦兰锋;石德顺;;兔皮肤成纤维细胞的体外培养和NESTED-PCR支原体污染检测[J];安徽农业科学;2008年13期
4 刘萍;王海飞;汪劲能;陆艳凤;赵西彪;丁家桐;;Kiss-1基因在猪初情期下丘脑-垂体-卵巢轴中的定位研究[J];安徽农业科学;2008年15期
5 董社琴;李冰雯;;对节白蜡愈伤组织诱导的研究[J];安徽农业科学;2008年26期
6 王怡;管鹏飞;薛整风;成勇;;利用SRY基因鉴定山羊胎儿成纤维细胞的性别[J];安徽农业科学;2009年16期
7 毕琳;李键;王中乾;;小鼠乳腺上皮细胞体外原代培养方法研究进展[J];安徽农业科学;2010年07期
8 周德存;;人幼儿心肌细胞体外培养的实验研究[J];安徽医学;2009年01期
9 王敏芳;张莉;;房颤的基因定位方法及其进展[J];安徽医药;2012年07期
10 朱晓峰,张荣华,彭柯萍;益骨胶囊含药血清对体外培养成骨细胞分泌IGF-Ⅰ的影响[J];安徽中医学院学报;2003年02期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 王治国;袁耀明;;乳腺上皮细胞体外培养的研究进展[A];第三届中国奶牛发展大会论文集[C];2008年
2 李忠秋;孙金艳;马红;郭镇华;吴赛辉;彭福刚;;成年种公牛耳皮成纤维细胞的分离与培养[A];首届中国奶业大会论文集(上册)[C];2010年
3 郭勇;张西正;魏严;张永红;;新生大鼠心肌细胞的体外培养和工程化心肌组织的初步构建[A];第八届全国生物力学学术会议论文集[C];2006年
4 刘爱国;;代谢组学在植物系统研究中的应用[A];2009年中国药学大会暨第九届中国药师周论文集[C];2009年
5 刘爱国;;代谢组学在植物系统研究中的应用[A];2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集[C];2010年
6 王林美;范琦;张波;叶博;赵振军;李树英;;柞蚕蛹卵巢原代细胞培养方法的研究[A];中国蚕学会第六届青年学术研讨会论文集(3)[C];2009年
7 赵康峰;郭宝岚;张少平;孔建;治洪;刘景兰;张月;李毅民;;脑星型胶质细胞改进培养法[A];中国毒理学会生化与分子毒理专业委员会第六届全国学术会议、中国毒理学会遗传毒理专业委员会第五届全国学术会议、广东省预防医学会卫生毒理专业委员会学术会议、广东省环境诱变剂学会学术会议论文汇编[C];2008年
8 程树军;杜淑娟;邹志飞;;ESC与PHBV体外构建新型化妆品检测用皮肤的初步研究[A];2006年中国化妆品学术研讨会论文集[C];2006年
9 王志跃;万秋蓓;杨海明;;新扬州鸡IGF-1基因5′调控区PstI位点多态性及其与蛋品质关系的研究[A];中国家禽业——机遇与挑战——第十三次全国家禽学术讨论会论文集[C];2007年
10 王春生;杜文敬;原璐;安铁洙;;绵羊高硫角蛋白启动子(B2C)表达活性研究[A];中国畜牧兽医学会动物解剖学及组织胚胎学分会第十五次学术研讨会论文集[C];2008年
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1 殷慧群;猪诱导性多潜能干细胞的建立[D];安徽农业大学;2010年
2 李明玉;硬骨鱼类IGF信号通路两个重要基因的结构和功能研究[D];中国海洋大学;2010年
3 邵凌健;槐糖脂补料发酵及抗真菌、抗肿瘤活性的研究[D];山东大学;2010年
4 林源吉;K562及其耐药株K562/A02细胞膜蛋白与耐药机理的研究[D];浙江大学;2010年
5 杜瑞平;t10,c12-CLA对猪皮下和背最长肌脂肪沉积的差异性调控机理研究[D];内蒙古农业大学;2010年
6 李东杰;人脐带间充质干细胞促进创面愈合及体外诱导分化为表皮样细胞的实验研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2011年
7 袁烁;化瘀消癥杀胚法对输卵管妊娠影响的临床与实验研究[D];广州中医药大学;2011年
8 梁洋;蜘蛛拖丝蛋白基因Spidroin1嵌合体小鼠的研究[D];东北林业大学;2011年
9 赵丽;三种重金属单抗的制备与抗体基因序列分析及其免疫检测方法的建立[D];内蒙古农业大学;2011年
10 迟春萍;人铜锌超氧化物歧化酶在毕赤酵母中高表达及其中试工艺研究[D];吉林农业大学;2011年
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1 田振华;伴与不伴脂肪细胞共培养状态下IL-6对人单核/巨噬细胞增殖和功能的影响[D];南京医科大学;2009年
2 宋晓娣;笋用竹的组织培养研究[D];中南林业科技大学;2009年
3 刘建民;“复瓣玫瑰红”蔷薇的快繁技术研究[D];山东农业大学;2010年
4 何淑玲;红芪高产配套栽培技术试验研究[D];甘肃农业大学;2010年
5 王云丹;阳和汤体外对成骨细胞的增殖作用及对破骨细胞的分化影响[D];湖南中医药大学;2010年
6 李永忠;壮骨镇痛胶囊含药和血浆对共育体系中破骨细胞活性及凋亡的影响的实验研究[D];湖南中医药大学;2010年
7 鲍腾飞;铁皮石斛组织快繁及生物反应器培养研究[D];浙江农林大学;2010年
8 郭雪阳;两种星鲽组织细胞系的建立及三丁基氧化锡对其毒性作用的研究[D];中国海洋大学;2010年
9 李文峰;大菱鲆(Scophthalmus maximus)体细胞培养及其在病毒研究中的应用[D];中国海洋大学;2010年
10 段依敏;新疆和田地区居民碘盐食用情况调查研究[D];新疆医科大学;2010年
【同被引文献】
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1 尚克刚,胡新立,李子玉,王学庆,刘爱民,孟国良,童英;饲养层对维持新建ES细胞系的影响[J];北京大学学报(自然科学版);1994年04期
2 尹学钧;DD-PCR技术及其在遗传毒理学的应用前景[J];国外医学(卫生学分册);1999年03期
3 李臻,张远强,王瑞安;原始生殖细胞迁移的分子机理[J];解剖科学进展;1999年02期
4 赖良学,郑瑞珍,孙方臻,秦鹏春;胚胎干细胞分离培养的影响因素[J];解剖科学进展;1995年03期
5 郭雨霁,高英茂,邴鲁军,李盛芳;小鼠胚胎干细胞构建嵌合体的方法[J];解剖学报;2004年03期
6 刘永刚,韩兵,陈地龙,李芳菲,王亚平,王莎莉;人胚胎生殖细胞在人胚胎成纤维细胞饲养层上的生长[J];解剖学报;2005年03期
7 曲文玉,谭季春,李杨,孙开来,邱广蓉,王淑玲,蒋丽,卓英梅;子宫内膜基质细胞作为饲养层培养人胚原始生殖细胞[J];解剖学报;2005年03期
8 窦忠英,徐小明,华进联;牛胚胎干细胞建系研究进展及存在问题[J];农业生物技术学报;2003年05期
9 张春雨,段恩奎,曾国庆;白血病抑制因子及其在胚胎发育和胚泡着床中的生理功能[J];生理科学进展;1997年03期
10 郭雨霁,高英茂,韩爱民;胚胎干细胞的分离与培养[J];生命的化学;2002年06期
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1 刘永刚;人EG细胞分离、培养及其定向诱导为造血细胞的实验研究[D];重庆医科大学;2005年
2 华进联;人类胚胎生殖细胞的分离克隆及生物学特性研究[D];西北农林科技大学;2005年
3 安立龙;牛胚胎干细胞的分离与克隆[D];西北农业大学;1999年
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1 王桂红;干细胞因子在女性生殖过程中作用的初步研究[D];中国人民解放军第四军医大学;2003年
2 于海生;人胚胎生殖细胞的分离培养与鉴定[D];西北农林科技大学;2006年
3 李希;水牛卵母细胞体外成熟前后基因差异表达的研究[D];广西大学;2008年
4 魏著英;杂合孤雌胚胎干细胞的分离及其分化潜能的研究[D];内蒙古大学;2008年
【二级参考文献】
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1 周向东,刘凌志,钱桂生,黄桂君,陈杰;一条新的人肺腺癌耐药相关基因全长cDNA片段的克隆及序列分析[J];癌症;2002年04期
2 严云勤,谭景和,张黎霞;小鼠早期胚胎发育过程中TGF-α和EGF-R mRNA的表达[J];动物学报;2002年04期
3 王海晶;杨和平;周向东;;MDR相关新基因CA916798真核表达载体的构建及其对H446细胞增殖的影响[J];第三军医大学学报;2007年24期
4 李艳红,姚元庆,姚兵,黄威权,杨梦庚;原癌基因c-myc产物在小鼠早期胚胎中的表达[J];第四军医大学学报;2000年02期
5 李艳红;早期胚胎中的基因表达[J];国外医学.妇产科学分册;2000年06期
6 陈照丽;IGF系统的生物学功能及其与肿瘤的关系[J];国外医学(分子生物学分册);2003年01期
7 周银松,葛红山,丁家桐;哺乳动物胚胎着床前的基因表达与调控[J];国外畜牧科技;2001年01期
8 萧浪涛;现代生物信息学及其主要研究领域[J];湖南农业大学学报(自然科学版);2000年06期
9 秦松,张健,李文斌,王希华,童顺,孙勇如,曾呈奎;用基因枪将GUS基因导入褐藻细胞中表达[J];海洋与湖沼;1994年04期
10 武建秋,王希华,秦松,曾呈奎;海带基因工程选择标记的研究[J];海洋科学;1995年05期
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1 张志民,陈万欣;生长激素与心脏[J];承德医学院学报;2001年03期
2 丁延峰,何瑞荣;胰岛素样生长因子I对心脏的作用[J];生理科学进展;2000年03期
3 刘军建,袁仕取,朱作言;鲑鱼胰岛素样生长因子IcDNA在镜鲤中的表达[J];云南大学学报(自然科学版);1999年S3期
4 白俊杰,叶星,李英华,李新辉,简清,罗建仁;草鱼胰岛素样生长因子-Ⅰ基因克隆及序列分析[J];水产学报;2001年01期
5 蒋世翠;张明哲;王义;孙春玉;李校堃;张美萍;;人参SQS基因的干扰载体构建及转化人参愈伤组织[J];吉林大学学报(理学版);2011年06期
6 刘杰,章汉旺,朱桂金,李豫峰,靳镭,侯小妮;胰岛素样生长因子-I调节胚胎着床的体外研究[J];中国妇幼保健;2005年03期
7 李吉涛;牟玉莲;张莉;冯书堂;;Laron综合症的研究进展[J];实验动物科学;2007年05期
8 陈粤,T LIN,ML NAGPAL;胰岛素样生长因子-I和人绒毛膜促性腺激素对成年大鼠Leydig细胞葡萄糖转运蛋白基因表达调控[J];汕头大学医学院学报;2005年02期
9 赵亮,郝运运,徐秀英,陈家琦;有氧耐力训练对青春期少年血清IGF-I和GHBP水平的影响[J];天津体育学院学报;2000年04期
10 张应华;王小佳;;用于转化甘蓝的胰岛素样生长因子Ⅰ的合成及MAR调控的表达载体构建[J];农业生物技术学报;2004年06期
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1 蔡德培;李嫔;;补肾中药对下丘脑—垂体—生长轴功能的调节作用[A];第十一次全国中西医结合儿科学术会议论文汇编[C];2004年
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1 ;治疗办法多 因人而异好[N];医药经济报;2001年
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1 李吉涛;五指山猪近交系矮小性分子遗传基础研究[D];中国农业科学院;2007年
2 谢家敏;人牙乳头间充质细胞的分离培养及生长分化的实验研究[D];四川大学;2005年
3 方颖;胰岛素样生长因子Ⅰ对糖尿病大鼠拔牙后牙槽骨改建的影响及其机制的基础研究[D];第四军医大学;2006年
4 刘丹;胰岛素样生长因子系统在CLD中的作用及其机制的研究[D];中国医科大学;2007年
5 胡细连;大熊猫等濒危动物IGF-Ⅰ基因的克隆、表达与组织分布研究[D];浙江大学;2005年
6 白晓红;卵母细胞体外成熟培养的研究[D];天津医科大学;2002年
7 温建勋;牛早期胚胎发育过程中差异表达基因及其作用的研究[D];内蒙古大学;2012年
8 朱志刚;外源性人胰岛素样生长因子Ⅰ基因在人关节软骨细胞中的表达及对其增殖影响的实验研究[D];第一军医大学;2006年
9 黄金明;CREB-1载体的构建及其对HSC中内源性TGF-β3分泌的影响[D];华中科技大学;2012年
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1 杨美玲;转过表达和低表达胰岛素样生长因子Ⅰ基因牛成纤维细胞系的制备[D];内蒙古大学;2009年
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