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《内蒙古农业大学》 2011年
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汉赛巴尔通体P17基因原核表达及间接ELISA检测方法的建立

武燕斌  
【摘要】:目的:为临床上应用间接ELISA方法检测汉赛巴尔通体病原体,本文通过对汉赛巴尔通体P17基因原核诱导表达,用获得的重组蛋白分析研究间接ELISA检测方法的最佳条件。 方法:根据Genebank上的基因序列,对汉赛巴尔通体特有P17(片段长度为525bp)进行PCR扩增,并克隆到pET-28a载体上。将重组质粒转化到大肠杆菌DH-5α中,用l mmol/LIPTG诱导P17蛋白表达,然后将Ni-NTA柱纯化的目的蛋白作为抗原建立汉赛巴尔通体的人临床间接ELISA检测方法。 结果:成功获得了分子量为22.6KD、浓度为3.44mg/mL P17基因重组蛋白。建立了间接ELISA方法的最佳条件为:P17基因蛋白稀释浓度为1.25μg/ml,包被37℃2小时,5%脱脂奶37℃封闭1h,待检血清稀释度为1:400,37℃孵育1h,HRP-羊抗人IgG浓度1:5000,37℃孵育1h,底物37℃避光显色25min,阴阳临界值为0.1238。利用已建立的ELISA方法检测上海地区91份和辽宁省393份临床血清样品,阳性血清分别为阳性率为24.17%和19.59%。 结论:成功建立了人临床汉赛巴尔通体抗体检测的间接ELISA方法,该方法特异性、重复性及敏感性高。此外,应用原核重组表达并纯化的抗原蛋白的方法,具有成本低,操作简便,结果可信等特点,为将本研究中建立的ELISA应用于生产的实践和临床诊断中提供可靠的实验依据和理论基础。
【学位授予单位】:内蒙古农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R440

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