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《内蒙古农业大学》 2011年
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蒙古绵羊β-防御素-1的表达、纯化及生物学功能研究

赵鹏伟  
【摘要】:背景:抗菌肽是构成先天性免疫的重要组成物质。β-防御素是一种含有6个半胱氨酸残基,前原肽由64个氨基酸构成的一种阳离子多肽。主要存在于动物的上皮组织中。防御素的成熟肽形式其分子量为3.5~6 kDa,富含精氨酸,富含阳离子。它可以对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和病毒等产生抑制作用。 目的:寻找绵羊β-防御素-1(sBD-1)的活性区域且建立可以通过基因工程的方法得到有生物活性的、大量的、易纯化的绵羊sBD-1的方法。 方法:含sBD-1信号肽序列的前原肽(psBD-1)和不含信号肽的sBD-1(msBD-1)在大肠杆菌BL21(DE3)表达,而后将表达产物通过金属螯合层析,肠激酶切,脱盐和冷冻干燥后,将其作用于大肠杆菌。得到了sBD-1的活性区域msBD-1。而后又分别构建了Ppic9k-msBD-1和在其C末端加6个组氨酸标签的Ppic9k-msBD-1-T的巴斯德毕赤酵母表达载体。进行了甲醇诱导表达,并对其表达的时间,培养基的pH,OD600和甲醇的浓度进行了优化,之后将其进行了大规模的发酵罐表达。将发酵后的发酵液进行了纯化。而后msBD-1和msBD-1-T进行了生物学功能鉴定。分别对大肠杆菌(Escherichia coli,E. coli) CMCC 44101,金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus,S. aureus) CMCC 26003,变形杆菌(Proteusbacillus vulgaris,P.vulgaris) CMCC 49001,绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa,P. aeruginosa) CMCC 10102,和痢疾杆菌(Shigella flexneri,S. flexneri) CMCC 51285进行了抑菌圈的比较。并且进行了msBD-1和msBD-1-T对Hek293细胞中CCR6-CCL20通路的影响以及对Hek293细胞的趋化移动作了研究。 结果:通过原核表达,得到了msBD-1为绵羊sBD-1的活性区域。而后在毕来酵母表达,msBD-1和msBD-1-T在诱导24 h时,培养基pH为4.4,甲醇浓度为4%时它们的表达量最高。之而又进行了大规模的发酵罐表达。表达后Ppic9k-msBD-1-T通过金属螯合层析,Sepdex-G10和冷冻干燥后获得。而Ppic9k-msBD-1则通过不同pH的磷酸缓冲液-阳离子交换层析,分子筛和冷冻干燥获得。之后进行了抑菌实验,得到msBD-1和msBD-1-T对E. coli, S. aureus, P. vulgaris, P. aeruginosa和S. flexneri均有抑制作用。而在化学诱导实验中,msBD-1和msBD-1-T均可使Hek293细胞作定向移动,并且可诱导CCR6的表达量增加,而CCL20无变化。 结论: 1.蒙古绵羊β-防御素-1的抗菌活性是在细胞内经胞质内相关酶的加工后分泌到胞外发挥其生物学功能。 2.成功构建了巴斯德毕赤酵母表达载体Ppic9k-msBD-1和Ppic9k-msBD-1-T,将其转入巴斯德毕赤酵母GS115中。并成功的将巴斯德毕赤酵母表达系统由摇瓶水平扩大至发酵罐水平,为进一步的进行大规模的生产奠定了基础。 3.建立了msBD-1和msBD-1-T的纯化系统。尤其是msBD-1的纯化,这为进一步大规模获得成熟绵羊β-防御素-1提供了实验室基础。 4. msBD-1和msBD-1-T均具有抑制细菌生长的作用,说明在防御素的C未端加6个HIS标签对防御素抗菌作用没有影响,由于HIS标签是带正电荷的氨基酸残基,因此还增强了msBD-1的抗菌活性。同时msBD-1和msBD-1-T均具有化学诱导功能。它们可诱导人胚胎肾细胞中CCL20的配体CCR6的表达量升高。同时也可以使人胚胎肾细胞作定向移动。
【学位授予单位】:内蒙古农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S826;S852.4

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