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鲁西黄牛胚胎骨骼肌卫星细胞分离培养及生物学特性研究

边艳超  
【摘要】:骨骼肌卫星细胞(satellite cells,SCs)最早由Mauro在蛙胫前肌中发现,具有较强的自我更新、增殖和多向分化潜能,在体外培养条件下能跨胚层分化为多种细胞类型。鲁西黄牛是世界上著名的肉用牛,已列入国家级畜禽遗传资源重点保护品种名录。本研究旨在建立鲁西黄牛胚胎骨骼肌卫星细胞体外扩增培养体系,并探索其低、中、高代次细胞增殖、分化等生物学特性,结论如下: (1)本研究选取鲁西黄牛四肢骨骼肌,采用机械分离法、联合酶消化法及差速贴壁法,成功分离获得牛SCs,优化了牛SCs体外扩增的最佳培养体系,并将牛SCs成功传至23代,冻存后牛SCs仍具有较高的细胞活率。 (2)免疫细胞化学染色检测牛SCs标志物表达,结果显示,P4、P9、P20代牛SCs均为Desmin、MyoD阳性表达;RT-PCR检测牛SCs标志物表达,结果显示P4、P9、P20代牛SCs均为Desmin、Pax7、c-Met、Myf5阳性表达,且灰度分析结果显示,不同代次SCs同一标志物表达量差异不显著,符合SCs标志物表达情况。 (3)P4、P9、P20代牛SCs生长曲线均呈标准“S”型,分别经历了潜伏期,对数生长期和平台期;不同代次SCs均具有较高的克隆形成能力,但克隆形成率随着细胞代次增加而降低;流式细胞仪分析SCs细胞周期,结果显示,随着细胞代次的增加,G0/G1期细胞比例增加,S期细胞比例下降。 (4)牛SCs染色体数目为2n=60,且染色体形态无畸变,除性染色体外,均为端着丝粒染色体,表明本试验分离获得的SCs均来自正常的鲁西黄牛胚胎个体。 (5)在不同的体外诱导条件下,诱导P4、P9、P20代牛SCs向成肌细胞、脂肪细胞、成骨细胞、神经细胞和表皮细胞分化。应用相应的染色方法检测诱导效果,结果显示,不同染色方法均呈阳性表达;RT-PCR检测SCs向不同细胞诱导后相应标志物的表达,包括成肌细胞标志物fast skeletal myosin,脂肪细胞标志物PPARγ、LPL,成骨细胞标志物osteopontin、Collage type Ⅰ,神经元标志物MAP2、nestin和表皮细胞标志物α6和CK19,结果显示,所有标志物均呈阳性表达。对目的基因表达量进行灰度分析发现,中、低代次SCs分化能力无显著差异,高代次SCs的分化能力显著降低。 实验证明,鲁西黄牛胚胎SCs适合在体外分离培养,经多次传代培养后,低、中、高代次SCs仍具有较强的自我更新、增殖和分化等生物学特性,且具有取材方便,获得细胞数量多等优点,可作为一种理想的种子细胞来保存鲁西黄牛这一珍贵的遗传资源,也为SCs在临床上的应用提供实验依据。


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