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蒙古马免疫相关基因表达研究及脾脏表达谱分析

赵一萍  
【摘要】:中国马业正处在从传统马业向现代马业转型的过程中,急需培育出适应我国自然环境的马匹新品种(系)。为此,对优良地方品种蒙古马免疫相关基因进行研究,不但可以进一步了解蒙古马抗病力强的原因,为揭示蒙古马抗病力遗传特性提供理论依据,而且可以对蒙古马种质资源的保护、利用和创新起到积极的作用,并指导地方品种马的杂交改良、品种(系)的培育。本研究以蒙古马为研究对象,以纯血马为对照,首先对蒙古马与纯血马血液生化、免疫和抗氧化指标进行测定分析,判断正常生理情况下,蒙古马与纯血马血液指标是否存在差异,从总体上掌握两个品种马抗病力的情况;其次,对马匹抗病候选基因TLR2、TLR4多态性进行研究,分析两个品种马基因型的差异性;再次,采用实时荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)的相对定量方法对两个品种马不同组织中TLRs基因的表达量进行差异分析,同时对在脂多糖(LPS)诱导下的两个品种马单核细胞与免疫相关基因的差异表达进行研究,得到各基因的相对表达量,进而分析免疫相关基因对不同品种间抗性的影响;最后,利用高通量测序技术对蒙古马与纯血马脾脏表达谱文库进行测序,以寻找两个品种马脾脏组织中的差异表达基因。通过本研究的结果可以为揭示蒙古马抗病力遗传特性提供理论依据,并获得以下主要研究结果: 1.通过对血液生化、免疫和抗氧化指标的结果分析发现,纯血马血液中白蛋白和胆固醇的含量偏高,这与其饲料营养水平相一致;蒙古马血液中球蛋白、IgG和IgA的含量均显著高于纯血马(P<0.05),推测与蒙古马的免疫力高有关。 2.采用PCR-SSCP技术对蒙古马与纯血马TLR2基因进行分型,两个群体都呈现出三种基因型(AA、AB和BB型);经测序发现该基因外显子存在两处突变:编码区945bp位置G→C的同义突变和1070bp位置G→A的错义突变;由于密码子的摆动性,945bp位置并未导致精氨酸的突变;而1070bp位置由精氨酸突变为谷氨酰胺。对基因型统计分析,蒙古马与纯血马品种之间不同基因型分布存在显著差异(0.01≤P<0.05)。 3.通过直接测序方法发现,蒙古马与纯血马TLR4基因第3外显子共发现11处碱基突变,其中8处(520bp位置T→G,668bp位置A→G,817bp位置C→T,1003bp位置C→T,1513bp位置T→C,1546bp位置G→A,1771bp位置T→C和1903bp位置T→C)为同义突变;其他3处,713bp位置C→A导致谷氨酰胺变为赖氨酸,1353bp位置T→C使甲硫氨酸变为苏氨酸,1673bp位置A→G导致甲硫氨酸变为缬氨酸,并且这3处不同基因型分布存在极显著差异(P<0.01)。 4.采用RT-qPCR的2-△Ct方法对蒙古马与纯血马TLR1-9基因在肝脏、脾脏、肺脏、盲肠和骨髓组织进行了差异表达研究。结果表明各基因在5个组织中均有表达;TLRs基因在免疫器官(脾脏和骨髓)中的表达量为蒙古马高于纯血马;而在肝脏中为蒙古马低于纯血马。 5.马外周血单核细胞经LPS刺激后,无论是蒙古马还是纯血马TLR4、CD14、MD-2、TNF-α、INF-β、IL-1β、IL-6和IL-8基因表达量都有所增加(与对照组相比);TLR4、CD14、IL-1β、IL-6和IL-8基因的表达量均是蒙古马低于纯血马,其中TLR4基因和IL-1β基因表达差异显著(P<0.05)。单核细胞上清液中细胞因子(TNF-α、INF-β、IL-1β和IL-8)含量在两个品种之间差异不显著(P≥0.05)。 6.构建了蒙古马-脾脏和纯血马-脾脏组织表达谱文库,经Illumina Miseq高通量测序,分别获得了6811804和7744386有效reads;两个文库Map到8号和1号染色体的reads最多,而Map到29号、30号和31号染色体的reads最少;两个文库共筛出279个差异表达基因,其中与免疫相关的基因有45个。GO功能富集分析结果表明差异表达基因与生物学过程、细胞组分和分子功能有关;KEGG通路富集分析结果表明差异最大的显著富集KEGG条目为免疫系统。


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