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绵羊羊水来源多潜能干细胞生物学特性研究

王凤武  
【摘要】:近年来,在人和动物的羊水中发现一类多潜能干细胞(Amniotic fluid-derived stem cells, AFSC), AFSC生长无需滋养层细胞,能够表达胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells, ESCs)和成体干细胞(Somatic Stem Cell, SSC)的标志基因,体外悬浮培养能形成类胚体,因此,羊水来源干细胞被认为具有发育全能性并在体内可能发挥极其重要的生理功能。 本试验研究中,采用两种不同的分离培养方法共从绵羊羊水以及胎儿肾组织中成功分离培养3株表达Oct4和SSEA-1多潜能干细胞。采用干细胞通用分离培养方法,以鼠胚胎干细胞培养液成功分离培养一株羊水来源多潜能干细胞(AFSC), AFSC表达主要组织相容性抗原(major histocompatibility gene, MHC)MHC-Ⅰ不表达MHC-Ⅱ,称之为AFSC-Ⅰ。在此基础上,通过调整培养液组成,采用低浓度胰酶培养液培养,从同—受孕中期绵羊的羊水和胎儿肾组织中分别分离培养1株多潜能干细胞。其中,羊水来源的干细胞表达MHC-Ⅱ,不表达MHC-Ⅰ,称之为AFSC-Ⅱ,肾组织来源的多潜能干细胞(The renal tissue pluripotent stem cells, RTSC)表达MHC-Ⅱ,不表达MHC-Ⅰ,称之为RTSC-Ⅱ。 RT-PCR分析结果表明,AFSC-Ⅰ表达ESCs相关标志基因Oct-4、Nanog,胚胎生殖细胞(Primordial germ cells,EGCs)标志基因SSEA-1及间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSC)相关标志基因CD117、SH2等,主要组织相容性抗原MHC-Ⅰ,不表达MHC-Ⅱ。Real time PCR分析结果表明,AFSC-Ⅱ和RTSC-Ⅱ均表达ESCs相关标志基因Oct-4,胚胎生殖细胞标志基因SSEA-1,主要组织相容性抗原MHC-Ⅱ,细胞凋亡基因Bcl-2以及抑制细胞凋亡基因Bax,不表达MHC-Ⅰ、Nanog以及Tert。基因表达相对定量分析表明,AFSC-Ⅱ的Oct-4相对表达量是RTSC-Ⅱ的1.8倍,而AFSC-Ⅱ的SSEA-1相对表达量是RTSC-Ⅱ的1.12倍,AFSC-Ⅱ的Bcl-2和Bax的相对表达量约为RTSC-Ⅱ的2倍。在AFSC-Ⅱ中Bax、Bcl-2基因的相对表达量是SSEA-1的62、63.7倍,Bax/Bcl-2约为0.97。在RTSC-Ⅱ中, Bax、Bcl-2基因的相对表达量是Oct4的133,105倍,Bax/Bcl-2约为1.3。AFSC-Ⅰ、AFSC-Ⅱ和RTSC-Ⅱ体外悬浮培养7d后均能形成类胚体。RT-PCR检测结果表明类胚体表达三胚层特异标志基因fgf5(外胚层)、α-fetoprotein(内胚层)和ξ-globin(中胚层)。AFSC-Ⅰ培养至40代,AFSC-Ⅱ和RTSC-Ⅱ至10代,二倍体核型检测正常率分别为94%、88%、90%。非正常核型为染色体数目发生倍增。 以携带有强启动子CMV的p CMV-DsRed为报告质粒,脂质体法介导转染AFSC-ⅠI和RTSC-Ⅱ,流式细胞仪分析,结果表明基因的瞬时转染效率为分别为68.61%、69.17%,通过浓度为6mg/mL的G418快速筛选获得纯化转基因AFSC-Ⅱ和RTSC-Ⅱ。转基因AFSC-Ⅱ和RTSC-Ⅱ体外悬浮培养7d均能形成类胚体。Real time PCR分析,结果显示转基因AFSC-Ⅱ和RTSC-Ⅱ均表达Oct-4、SSEA-1、Bax、Bc1-2和MHC-Ⅱ,不表达MHC-Ⅰ、Nanog以及Tert。AFSC-Ⅱ在转染后,相对表达量分析显示,SSEA-1的表达量显著增加,Oct-4、Bax的表达量略有下降,而Bcl-2却出现明显下降。而RTSC-Ⅱ转染后,相对表达量分析显示,Oct-4的表达量显著增加,其相对表达量为转染前的13倍,SSEA-1的表达量未发生明显变化,而Bax和Bcl-2的表达明显下降。在AFSC-Ⅱ转染后,Bax、Bc1-2的相对表达量为SSEA-1的53.4、36.6倍,Bax/Bcl-2约为1.5。在RTSC-Ⅱ转染后Bax、Bcl-2的相对表达量为Oct4的5.5、3.1倍。Bax/Bcl-2约为1.8。 研究结果显示,绵羊羊水干细胞的生物学特性与胚胎干细胞类似,但是又有别于胚胎干细胞。同时,体内机体组织中有与羊水干细胞类似细胞存在意味着羊水干细胞有可能在人与动物的机体组织中扮演着重要的角色。因此,对羊水干细胞的生物学特性进行深入系统研究具有重要的理论和实践意义。


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