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嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌产酸、风味特性及其功能基因分型和表达研究

刘文俊  
【摘要】:嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌是制作发酵乳制品最重要的发酵剂菌种,具有重要的经济价值和应用研究潜力。这两种酸奶发酵菌通过共生互作使牛奶快速酸化,并且赋予酸奶特有的风味和良好的质地。本论文以内蒙古农业大学乳酸菌菌种资源库中保藏的从不同地区和不同乳源分离的嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌为研究对象。应用传统实验室发酵方法对43株嗜热链球菌和39株保加利亚乳杆菌进行了酸奶发酵实验,测定发酵时间、产酸速率和乙醛、双乙酰等风味物质在发酵及贮藏期间的含量变化,研究在发酵和贮藏期间两种菌的产酸特性和风味物质含量变化规律;同时应用嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌与发酵、产酸和风味形成特性相关的功能基因多位点序列分型(MLST)方法,进行菌株系统发育和遗传进化研究。对具有不同发酵特性和风味物质形成特性的代表性菌株进行了功能基因q-PCR定量分析,研究不同菌株,在不同贮藏时间点关键基因表达变化与上述表型指标变化之间的关系。主要研究结果如下: 首先,在发酵过程中每隔2h测定pH、滴定酸度和活菌数;发酵结束后在酸奶贮藏期间的0、8、12、24、36、48h和7、14、21d别测定pH、滴定酸度、活菌数、乳酸含量、乙醛含量、双乙酰含量等指标。研究嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌酸奶在发酵过程中的发酵、产酸特性和贮藏期间产酸特性和风味物质含量的变化规律。结果表明:43株嗜热链球菌的发酵时间从4.5-24.5h有19株菌发酵时间小于10h,其中10株菌的产酸速率在10°T/h以上。39株保加利亚乳杆菌的发酵时间从8.5-24.5h,23株菌的发酵时间小于15h,其中有14株菌的产酸速率在3°T/h以上。从产酸和发酵特性而言,这些菌株有作为工业化发酵剂菌种开发的潜力。嗜热链球菌产生的主要风味物质乙醛含量变化范围:1.67-16.67μg/g,双乙酰含量变化范围:1.22-10.19μg/g。保加利亚乳杆菌产生的风味物质乙醛含量变化范围:1.81-56.81μg/g,双乙酰含量变化范围0.20-7.18μg/g。 其次,应用嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌与发酵、产酸和风味物质形成特性相关的功能基因的多位点序列分型(MLST)方法,进行了2种不同菌的功能基因系统发育和遗传进化研究。将菌株MLST分型的基因型结果与产酸特性和风味物质含量变化等表型指标进行联合分析。结果表明:43株嗜热链球菌依据其基因序列型可形成19个ST型,而将功能基因型与发酵时间、产酸和风味物质含量等表型数据联合分析则将菌株分为4个群,其中表型数据与功能基因型数据有良好的对应关系,特别是乙醛含量高的菌株在基因型上聚类为1个群组,乙醛含量中等的菌株聚类为1个组,低乙醛含量的菌聚类为1个群组。39株保加利亚乳杆菌依据其功能基因序列型也分成19个ST型,而将功能基因序列型和表型数据联合分析则将菌株分为4个不同的聚类。发酵时间和乳酸含量与基因型有良好的对应关系,即发酵时间短的菌(小于15h)聚类为1组,发酵时间中等的菌(15-20h)聚为1组,发酵时间长的菌(大于20h)聚类为1组,乳酸含量高的菌从基因型序列上聚类为1组,乳酸含量中等的菌从基因型上聚类为1组,而乳酸含量低的菌也从基因序列型上聚类为1组。这些研究结果表明酸奶发酵菌在酸奶环境中经过长期的选择压力和环境适应性驯化,在遗传和基因组序列上保留了与牛奶发酵和风味物质形成的功能基因序列。从而可以从这些菌种功能基因序列型上将具有期望出现的表型特征的菌株进行分组,为从分子生物学和基因水平进行具有特定发酵特性菌株的快速筛选奠定基础。 最后,对具有不同发酵、产酸特性和不同风味物质产量特性的代表性菌株进行了功能基因q-PCR定量分析。特别是对风味物质乙醛含量和双乙酰含量与关键功能基因表达之间的相关性进行了研究。结果表明:嗜热链球菌主要风味物质乙醛含量与功能基因pdc、lld、ald呈显著正相关,而基因lld表达量与基因pdc,lld等呈显著正相关,基因pfl表达与其它基因表达量相关性不显著。保加利亚乳杆菌乙醛含量也与功能基因pdc、lld、ald表达量呈显著正相关。基因lld表达量与基因ald表达量呈显著正相关,与pdc相关性不显著。对于2种菌的风味物质乙醛和双乙酰含量与贮藏时间的研究表明,贮藏24-36h是产生风味物质的关键时间段,之后随着贮藏时间的延长风味物质含量逐渐减弱。


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