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向日葵锈菌分泌蛋白预测及内参基因筛选

郭丹丹  
【摘要】:向日葵锈菌(Puccinia helianthi Schw.)引起的向日葵锈病在世界各地均有发生,严重影响向日葵产量及质量。为明确我国的向日葵锈菌生理小种组成、分布以及优势小种,我们对全国各向日葵主产区的80份锈菌菌样进行了生理小种鉴定,并通过鉴定多个向日葵品种的抗感病情况,了解品种抗病性差异。为深入了解向日葵-锈菌的互作机理,基于夏孢子萌发转录组数据,对编码分泌蛋白的序列进行了预测;为研究向日葵锈菌侵染过程中的基因表达情况,利用实时荧光定量PCR及软件分析方法,对向日葵锈菌生长发育和侵染阶段稳定表达的内参基因进行了筛选。研究主要结论如下:1.对2013-2014年我国北方向日葵主产区内蒙古东部、中部、西部、黑龙江、吉林、河北、山西、宁夏、新疆等33个地点采集的80份锈菌菌样进行了生理小种的鉴定,最终确定了15个生理小种。304小种为主要优势小种,所占比例为28%,其次是300、310小种,所占比例为18%,其它12个生理小种(314、324、330、332、334、350、354、374、500、526、736、737)所占比例范围为1%~6%。低致病力小种类群300种群所占比例高达87%,高致病力小种类群700种群所占比例为4%。同时,以优势小种304和毒性最强小种737为接种菌样,对从各产区选取的69个杂交品种和5个常规品种进行了品种抗性鉴定。对304小种,在31个食葵杂交品种中,6个表现为免疫,2个表现为高抗,11个表现为抗病。在38个油葵杂交种中,8个表现为免疫,3个表现为高抗,17个表现为抗病。5个食葵常规种对304均表现为感病。对于737小种,95%的品种表现为感病,仅有5%表现为抗病,且均为油葵品种。2.利用SignalP 4.1、TMHMM 2.0、TargetP 1.1、Protcomp 9.0、big-PI predictor5个软件预测程序对向日葵锈菌转录组中的35286条蛋白序列筛选,共获得908个分泌蛋白,所占比例为2.6%。其中长度在101--200aa之间的蛋白数量最多。信号肽长度多为18~20aa。有463个含有分泌途径信号肽,可被信号肽酶Ⅰ(SpI)切割,55个包含脂蛋白信号肽,可以被信号肽酶Ⅱ(Sp Ⅱ)切割。所有分泌蛋白中,未发现含有RR-motif结构。通过与GO数据库比对,131条分泌蛋白被归到生物过程,119条分泌蛋白被归到分子功能,80条分泌蛋白被归到细胞组分。908个预测的分泌蛋白中,581个具有功能描述,其功能主要集中在细胞信号识别与传导、细胞代谢、能量形成及转运等方面。代谢通路分析发现82(9.0%)个分泌蛋白序列获得了注释。我们还发现一些细胞壁降解酶及与大豆疫霉(Phytophthora sojae)同源的3条效应因子。3.利用实时定量RT-qPCR分析了11个持家基因在向日葵锈菌不同生长发育阶段(夏孢子、萌发芽管)及侵染向日葵阶段(接种后3d、14d)的基因表达情况。经过PCR扩增效率筛选,7个基因(UBC、UBCE2、UBQ、RPS24、TUBB、EF1、EF2)符合要求,可用于稳定度的筛选。利用geNorm、NormFinder和BestKeeper软件分析可知:UBC、UBCE2、UBQ、EFl可作为研究锈菌与寄主互作过程中基因表达的最适内参基因。


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