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《内蒙古农业大学》 2015年
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5-氨基乙酰丙酸结合二价铁对非酒精性脂肪肝缺血再灌注治疗的机理研究

李少伟  
【摘要】:各种实验室的评估数据表明非酒精性脂肪肝病已变为世界范围内成年人最常见的慢性肝病,发病人数仍在世界范围内增长。非酒精性脂肪肝(non alcoholic fatty liver disease,NAFLD)疾病谱系包括单纯性脂肪肝、非酒精性肝炎、肝硬化、肝癌。其中单纯性脂肪肝又最为常见,肝脏的脂肪性变是单纯性脂肪肝的重要特征。肝脏在人生命活动中起着重要作用,而且其功能十分复杂。一旦肝脏发生病变并到了终末期,先阶段的内科治疗尚无法恢复肝脏的全部功能。最好的办法就是换上一个或者是一部分健康肝脏。然而需进行肝移植和肝切除的肝病患者数量急剧增加,但由于缺乏足够的的正常肝脏组织供体而不得不使用脂肪肝替代健康的正常肝脏的现象越来越多,然而,脂肪肝对肝脏手术过程中发生的肝脏缺血再灌注(hepatic ischemia–reperfusion)引起的急性肝损伤的耐受性更低,使得肝移植手术后丧失肝功能的几率和风险变的更大。针对这种情况我们希望找到更简便而且有效的缓解脂肪肝缺血再灌注损伤的方法。5-氨基乙酰丙酸(5-Aminolevulinic acid,5-ALA)是一种内源性氨基酸,可以在动植物的线粒体中自主合成,目前作为一种在肿瘤诊断和治疗中使用的新型光敏剂和治疗剂。在体外实验中发现5-氨基乙酰丙酸结合二价铁(5-ALA+Fe2+)可以通过激活MAPK通路,通过活化Nrf2的的途径增强的血红素-氧合酶1(heme oxygenase-1,HO-1)的表达。HO-1是抗氧化酶的一种,功能为使血红素转化为胆红素或者胆绿素、CO还有铁离子,而这些代谢产物又有抗炎症反应,抗氧化反应等等保护作用。为此,研究使用高脂饮食并且不含胆碱和蛋氨酸(high fat,methionine-cholinedeficient diet,MCDHF)的饮食建立非酒精性脂肪肝病的小鼠模型,并模仿肝移植手术过程中经历的肝缺血再灌注过程建立小鼠的肝脏缺血再灌注模型,随后将两种模型结合形成小鼠非酒精性脂肪肝缺血再灌注模型,并应用5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)结合二价铁(Fe2+/SFC)在非酒精性脂肪肝小鼠的肝脏缺血再灌注模型中验证其对急性肝损伤的保护作用。主要实验和结果如下:实验一:模仿肝移植手术过程中经历的肝缺血再灌注过程建立了小鼠的肝脏缺血再灌注模型。采用暴露肝脏门静脉,无创金属夹夹闭门静脉主干。在用0.5ml生理盐水润湿后,用快速闭合器关闭腹腔切口,15分钟后恢复肝门血流1小时和3小时,均得到了可靠的小鼠肝脏缺血再灌注模型。该模型AST、ALT较正常小鼠显著升高。缺血再灌注模型肝脏组织HE染色发现有明显的炎性细胞浸润并伴轻微的肝细胞凋亡发生。结果显示此方法可以建立稳定的小鼠肝脏缺血再灌注模型。实验二:建立使用高脂并且缺乏胆碱和蛋氨酸的饮食造成的非酒精性脂肪肝和肝纤维化小鼠模型。并在其基础上建立了非酒精性脂肪肝小鼠的肝脏缺血再灌注模型。同时建立了小鼠由单纯性脂肪肝发展而成的肝纤维化或肝硬化模型。he染色和masson染色结果显示3周mcdhf饮食(mcdhf3w)可以导致小鼠大泡性脂肪肝产生,10周mcdhf饮食(mcdhf10w)可以导致小鼠肝脏在脂肪肝的基础上发生明显的纤维化。mcdhf3w组与mcdhf10w组小鼠血清ast、alt比正常饮食小鼠显著升高。同时mcdhf10w组血清ast、alt比mcdhf3w组高,但无显著差异。实时定量rt-pcr的结果显示mcdhf3w组小鼠炎性细胞因子:肿瘤坏死因子!(tumornecrosisfactoralpha,tnf-!),一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase,inos),骨调素(osteopontin,opn)较正常饮食组小鼠明显升高。使用流式细胞仪分析mcdhf诱导的非酒精性脂肪肝3周组和正常小鼠组,比较不同种类非实质细胞(non-parenchymalcells,npc)的数量变化。结果显示mcdhf3w组cd8阳性t细胞的数量显著高于正常小鼠,cd11b和b220阳性细胞的数量反而有所下降。于mcdhf3w模型小鼠行15分钟缺血后1小时(mcdhfi/r1h)或3小时(mcdhfi/r3h)再灌注,小鼠组血清ast、alt较mcdhf3w小鼠显著升高,而且mcdhfi/r1h组高于mcdhfi/r3h组,但无显著性差异。其结果与组织学观察结果吻合。显示可以建立稳定可靠的非酒精性脂肪肝/肝纤维化小鼠模型和非酒精性脂肪肝小鼠的肝脏缺血再灌注模型。实验三:应用ala+fe2+在非酒精性脂肪肝小鼠的肝脏缺血再灌注模型中验证其保护作用。发现肝脏缺血-再灌注的过程中,肝脂肪性变的小鼠与正常的小鼠相比alt和ast在血清中水平更高。硫代巴比妥酸反应产物(thiobarbituric-acid-reactivesubstances,tbars)含量在脂肪肝小鼠肝组织中中也显著提高,ala+fe2+给药以后alt和ast还有肝匀浆中tbars含量显著降低。肝脂肪变性缺血-再灌注损伤比单纯性的脂肪肝产生更多的凋亡肝细胞,主要表现为肝细胞凋亡早期过程中细胞核dna断裂(tdt-mediateddutpnickendlabeling,tunel)的阳性细胞的数量增加,ala+fe2+保护肝脂肪变性的缺血-再灌注组凋亡的肝细胞明显减少。脂肪肝的缺血再灌注组较单纯性的脂肪肝组显著增加f4/80阳性细胞数量,而经ala+fe2+干预的脂肪肝缺血再灌注组f4/80阳性细胞显著减少。rtpcr提示炎症因子、il-6、inos,opn,inf-"、tnf-!等在缺血再灌注后mrna表达显著升高,ala+fe2+保护后,mrna水平均明显降低。脂肪肝缺血再灌注的血红素氧合酶(hemeoxygenase-1,ho-1)mrna水平在ala+fe2+给药后较未给药组显著升高。同时检测肝脏组织一氧化碳(co)浓度显示,灌服ala+fe2+后,30分钟到1小时之间co浓度达到最高值,此时正是发生缺血后再灌注损伤的时间范围,综上所述ala+fe2+对非酒精性脂肪肝的保护机理包括降低活性氧含量、抑制肝实质细胞的凋亡、减少kupffer细胞激活、抑制炎性因子的表达以及增强HO-1的表达,在肝脏中产生更多的CO从而达到减少缺血再灌注对肝脏的损伤。实验四:体外培养巨噬细胞系(RAW 264.7)验证ALA+Fe2+在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激巨噬细胞产生的炎性环境中的保护作用和机制。实时定量PCR的结果表明在加入ALA+Fe2+的培养液中RAW264细胞在有LPS刺激和没有LPS刺激时,其OH-1 m RNA的表达水平均较未添加组显著升高,而且6小时组高于3小时组和阴性对照组。炎性因子如TNF-!、TGF-#等mRNA表达水平在LPS刺激3小时,6小时后较阴性对照组显著升高,在加入ALA+Fe2+的实验组,3小时,6小时后的表达显著降低。推断ALA+Fe2+可能通过增强HO-1表达缓解LPS刺激巨噬细胞的炎症反应。其结果与实验三MCDHF小鼠的体内实验结果相吻合。
【学位授予单位】:内蒙古农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:R575.5

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