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《内蒙古农业大学》 2017年
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绵羊肺炎支原体p60、p65蛋白分段表达及基于串联蛋白p60(N)-p65(C)间接ELISA检测方法的建立

麻昌姣  
【摘要】:绵羊肺炎支原体(Mcoplasma ovipneumoniae,MO)是能引起山羊和绵羊呼吸道疾病的一种重要病原菌。筛选出合适的蛋白作为包被抗原,建立特异性好、灵敏度高的间接ELISA方法对于临床检测有重要意义。本研究对MO膜蛋白p60和p65进行截短表达,分别扩增出这两种蛋白的N端与C端对应的基因序列,并通过SOE-PCR将p65的N端蛋白和p60的C端蛋白基因序列中的TGA突变为其同义密码子TGG;将扩增的目的片段分别插入到pET-32a(+)表达载体上,重组质粒分别转化至大肠杆菌感受态细胞BL21中进行诱导表达;通过Western blot试验分析所表达的四种重组蛋白的反应原性;然后以这四种蛋白和MO全菌破碎蛋白同时包被酶标板,检测30份临床羊血清样品,筛选出与以全菌蛋白包被的ELISA检测结果相近的重组蛋白。结果表明四种重组蛋白p60-N、p60-C、p65-N和p65-C均成功表达并具有反应原性,其中p60-N和p65-C两重组蛋白的ELISA检测结果与基于全菌蛋白ELISA检测结果符合度更高。根据以上的结果,进一步将P60-N和p65-C两蛋白的基因通过SOE-PCR方法进行串联;再进行蛋白的诱导表达、纯化及Western blot试验;然后建立基于该串联重组蛋白的间接ELISA方法,并对反应条件进行优化;用建立的间接ELISA方法检测临床血清样品MO抗体阳性率;并用该方法检测免疫过MO灭活疫苗的羊血清抗体效价;比较该方法检测结果同基于MO全菌蛋白的间接ELISA方法检测结果的符合率。结果表明建立的基于串联蛋白p60(N)-p65(C)的间接ELISA方法检测临床血清样品阳性率与基于全菌蛋白的间接ELISA方法检测结果符合率为90.67%,且利用这两种方法检测40份免疫血清的抗体效价趋势一致。综上所述,本研究以串联蛋白p60(N)-p65(C)为包被抗原,成功建立了间接ELISA方法,为进一步研制ELISA检测试剂盒奠定基础。
【学位授予单位】:内蒙古农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.62

【参考文献】
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