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《内蒙古农业大学》 2017年
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外源性绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白激活Akt/mTOR和MAPK信号通路并调控自噬的分析

孙晓林  
【摘要】:绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)为β逆转录病毒,属于Retroviridae家族和Othoretrovirinae亚家族。JSRV是绵羊肺腺瘤病(OPA)的病原,OPA是一种传染性的绵羊肺癌。JSRV囊膜蛋白(Envelope,Env)主要激活细胞中的PI3K/Akt和MAPK信号通路。研究表明,细胞自噬在很多种类型的癌症中均受到抑制。细胞的自噬活性往往和肿瘤的恶性发展程度相反。但是仍没有关于自噬形成过程与OPA肿瘤的发展过程,以及JSRV Env诱导细胞转化的过程之间关联的研究。自噬在JSRV Env转化的细胞中是怎样受到信号通路调控的,以及激活的信号通路是否调控细胞自噬,均值得我们深入探讨。本研究检测了 Akt/mTOR信号通路和MAPK信号通路在自然感染OPA病肺组织、JSRV Env转化的NIH3T3细胞和绵羊绒毛膜滋养层细胞中的激活情况。接着检测了自噬因子Beclin-1和LC3 Ⅱ/Ⅰ在自然感染OPA肺组织、JSRV Env诱导转化的NIH3T3细胞和绵羊绒毛膜滋养层细胞中的表达水平,并进一步研究了 Beclin-1和LC3 Ⅱ/Ⅰ是如何受到信号通路调控的,为探索JSRV-Env诱导转化细胞的致病机理奠定了研究基础。1.采集自然感染OPA绵羊病肺组织和作为阴性对照的健康绵羊肺组织,4%多聚甲醛固定的肺组织采用免疫组化法检测EGFR、Akt/mTOR和MAPK信号通路在OPA肺组织中阳性表达的定位情况,结果表明,OPA病肺组织中EGFR、p-Akt、p-mTOR、p-MEK1/2、p-ERK1/2、p-p38、p-JNK蛋白在腺瘤灶中大量表达,均定位于肿瘤细胞的细胞质和细胞核。-80 ℃保存的肺组织,提取总蛋白后采用Western blot法检测EGFR、Akt/mTOR和MAPK信号通路在OPA病肺组织中的激活情况,结果表明,EGFR、p-Akt、p-mTOR、p-MEK1/2、p-ERK1/2、p-p38、p-JNK 在 OPA 病肺组织中的磷酸化水平极显著高于健康肺组织。2.应用荧光定量qPCR的方法从采集的自然感染OPA病肺组织和作为阴性对照的健康肺组织的总RNA中扩增自噬因子Beclin-1和LC3的编码序列,分析Beclin-1和LC3在OPA病肺组织和健康绵羊肺组织中基因表达的差异,结果表明,Beclin-1和LC3在OPA病肺组织中的基因表达极显著低于健康肺组织中的表达。采用免疫组化法检测Beclin-1和LC3在OPA病肺组织中的阳性表达定位,结果表明,Beclin-1和LC3主要表达定位于OPA病肺组织的肿瘤细胞以及健康肺组织的肺泡上皮细胞和间质细胞中。采用Western blot法检测Beclin-1和LC3在OPA病肺组织和健康肺组织中蛋白表达的差异,结果表明,Beclin-1和LC3 Ⅱ/Ⅰ在OPA肺组织中的蛋白表达均极显著低于健康肺组织中的表达。3.将本实验室保存的真核表达质粒pcDNA4/myc-His/exJSRV-env瞬时转染NIH3T3细胞和绵羊绒毛膜滋养层细胞,分组实验为500 ng的重组表达质粒分别添加浓度梯度一为2μL、3μL、4μL、5μL,浓度梯度二为4μL、6μL、8μL、10μL的LTX,转染48 h后通过RT-PCR法和Western blot法检测最佳转染效率,结果表明,500ng的真核表达质粒中加入4 μL LTX为最佳转染浓度。4.应用Western blot法检测EGFR、Akt/mTOR和MAPK信号通路在JSRV Env转化的NIH3T3细胞和绵羊绒毛膜滋养层细胞中的激活情况,结果表明,EGFR、Akt/mTOR和MAPK信号通路在JSRV Env诱导转化的NIH3T3细胞和绵羊绒毛膜滋养层细胞中均有不同程度的激活。5.应用qPCR法和Western blot法检测Beclin-1和LC3在JSRV Env诱导转化的NIH3T3细胞和绵羊绒毛膜滋养层细胞中的表达情况,结果表明,Beclin-1和LC3Ⅱ/Ⅰ在JSRV Env诱导转化的NIH3T3细胞中的表达均极显著低于对照组细胞,Beclin-1在JSRVEnv诱导转化的绵羊绒毛膜滋养层细胞中的表达极显著低于对照组细胞,而LC3 Ⅱ/Ⅰ在JSRV Env诱导转化的绵羊绒毛膜滋养层细胞中的表达与对照组相比差异不显著。6.筛选mTOR抑制剂Rapamycin、ERK1/2抑制剂PD98059、JNK抑制剂SP600125、p38抑制剂SB203580的最佳抑制条件,结果表明Rapamycin、PD98059、SP600125、SB203580均分别在浓度为20μmol/L,添加48h后抑制效果最佳。阻断MAPK信号通路和Akt/mTOR信号通路后,qPCR法检测Beclin-1和LC3的基因表达水平,Western blot法检测Beclin-1和LC3的蛋白表达水平,结果表明,JSRV Env诱导转化的NIH3T3细胞和绵羊绒毛膜滋养层细胞中,阻断MAPK信号通路和Akt/mTOR信号通路后,Beclin-1和LC3 Ⅱ/Ⅰ的表达水平与对照组相比显著上调。本研究表明JSRV Env激活了靶细胞的MAPK和Akt/mTOR信号通路,并通过MAPK和Akt/mTOR信号通路的调节,抑制Beclin-1和LC3 Ⅱ/Ⅰ的表达。
【学位授予单位】:内蒙古农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.65

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