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《内蒙古农业大学》 2001年
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新城疫病毒F_48E_9株接种鸡胚的病理学观察及其P蛋白基因的克隆与表达

王海燕  
【摘要】: 将NDV F_(48)E_9株接种鸡胚进行病毒增殖,并对发病鸡胚作病理学观察, 可见病胚发育迟滞、胚体弱小、体表潮红、多处有出血点,胃、肠、肝、 脑、肾、心、骨骼肌等重要器官出现不同程度的充血、淤血、水肿、出血 和实质细胞的变质性变化,所收集的病胚的尿囊液纯化后经电镜观察可见 NDV粒子。 根据NDV P蛋白和M蛋白已知基因核苷酸序列设计并合成了两对引 物PU1/PL1和PU2/PL2。提取F_(48)E_9株RNA,以RT-PCR法扩增出大小约 1.1kb和1.6kb的目的基因片段,两者之间约有100bp左右的基因重复,将 这两个片段分别克隆到pMD18-T载体上,对阳性重组子经酶切分析、PCR 鉴定及序列测定证明是正确的。根据测序结果,再利用限制性内切酶 EcoRⅠ、HindⅢ、MseⅠ对两个重组质粒分别进行了酶切处理并回收目的片 段进行连接,所得的阳性重组质粒经酶切鉴定后再进行序列测定,结果证 实我们得到了NDV F_(48)E_9株P基因完整序列的克隆。通过序列分析发现 F_(48)E_9株P蛋白基因核苷酸序列与La Sota株的P蛋白基因核苷酸同一性为 87%,氨基酸同源性为91%,表明F_(48)E_9株与La Sota株有一定亲缘关系。 同时对其编码氨基酸的抗原性值分析,表明在20-28、113-122、190-200、 220-230位氨基酸等四个区域存在抗原表位。 根据NDV F_(48)E_9株P基因核苷酸序列和杆状病毒转移载体pF_(AST)B_(AC1)多 角体蛋白基因阅读框架,将重组质粒pMD18-T-P经HindⅢ作部分酶切, 再经EcoRⅠ酶切,然后与用EcoRⅠ/HindⅢ双酶切的杆状病毒转移载体 pF_(AST)B_(AC1)相连接,使P蛋白基因克隆到pF_(AST)B_(AC1)的多角体启动子下游。 经酶切分析、PCR鉴定及序列测定,证实获得了含P蛋白基因的转移载体 pF_(AST)B_(AC1)-P。然后将该转移载体转化到DH_(10BAC)感受态细胞中,经蓝白斑 筛选、挑菌、质粒提取,通过杆状病毒多角体蛋白基因通用引物及P基因 特异引物进行PCR鉴定,证实得到了重组杆状病毒DNA。将此重组组杆 状病毒DNA转染sf9昆虫细胞,于感染后72小时收获重组病毒粒子。再 将重组病毒感染对数生长期的sf9昆虫细胞,于感染后24、48、72、96小 时收获感染细胞,经SDS-PAGE电泳分析,证明NDV F_(48)E_9株P蛋白基因 在重组杆状病毒系统中获得了表达,其分子量大小约为56kD。
【学位授予单位】:内蒙古农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2001
【分类号】:S858.312.65

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