RAPD技术在苜蓿耐盐基因标记引物筛选上的应用
【摘要】：
耐盐苜蓿是适于盐碱地生长的优质牧草，是发展盐碱地区畜牧业生产的种质资源。本研究以耐盐苜蓿和敏盐苜蓿为对照材料，应用RAPD技术对苜蓿耐盐分子标记引物进行筛选，为苜蓿耐盐基因的定位，测序等工作奠定基础，为苜蓿的分子育种提供遗传物质基础。
首先以“中苜一号”、“大西洋”、“渭南”三个苜蓿品种为材料，热程序为：94℃预变性3分钟，再进入循环；94℃变性15秒；36℃退火30秒；72℃延伸1分钟。共45个循环．然后72℃延伸10分钟的条件下，对RAPD反应条件中各因子用量分别进行梯度试验，建立了稳定的RAPD反应体系。该体系总体积为25μl，MgCl_2浓度为2.7mmol／L，dNTP浓度为150μl／L，随机引物浓度为0.192μmol／L，TaqDNA聚合酶用量为每一反应体系2U，扩增缓冲液浓度为50mmol／L，模板DNA．用量为120～240ng／μl。
利用上述反应体系，对十二组240条引物进行筛选，发现在OPA、OPB、OPC、OPD、OPE、OPF、OPJ、OPH、OPG、OPN、OPX十一组引物中，分别有6、2、9、9、6、7、1、5、2、7、2条可产生多态性DNA片段，其中以OPD—5号引物稳定程度最好。利用该引物扩增，可在“中苜一号”、“AZ90NDCST”、“AZ-SALT-Ⅱ”三个耐盐苜蓿品种的DNA组中，产生稳定的3000bp多态性片段。而且，在“中苜一号”与“大西洋”、“渭南”的杂种F_1中有部分单株DNA组中也扩增出此带。供试的七个品种中，除国外四个品种外，其余三个品种在胁迫条件下，强化了耐盐与敏盐这一对相对性状。因此，可初步认定如果3000bp多态性DNA谱带与苜蓿耐盐性状连锁，则引物OPD-5就可作为苜蓿耐盐基因的标记引物。
【关键词】：苜蓿品种 RAPD 引物 扩增反应 优化 DNA多态性 耐盐性状 【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2001
【分类号】：S541.9
【DOI】：CNKI:CDMD:2.2002.090147
【目录】：
- 中文摘要2-3
- 英文摘要3-6
- 1、 前言6-15
- 1．1 我国土壤盐渍化基本情况及危害6
- 1．2 盐渍化土壤的改良6-8
- 1．3 耐盐碱植物对环境胁迫的调适8-11
- 1．3．1 植物的调适机理8-10
- 1．3．2 植物调适的遗传物质基础10
- 1．3．3 对耐盐苜蓿遗传物质的研究10-11
- 1．4 RAPD技术及其应用11-13
- 1．4．1 RAPD技术及特点11-12
- 1．4．2 RAPD技术的应用12-13
- 1．4．3 RAPD技术原理13
- 1．5 本试验的目的及任务13-15
- 2、 试验材料与方法15-21
- 2．1 试验材料15
- 2．2 试验方法15-21
- 2．2．1 DNA提取15-16
- 2．2．2 DNA组的检测16
- 2．2．3 DNA池的构建16-17
- 2．2．4 RAPD反应体系的建立17-18
- 2．2．4．1 RAPD反应热程序17
- 2．2．4．2 RAPD反应体系的优化17-18
- 2．2．5 苜蓿耐盐性状RAPD标记引物的筛选18-21
- 2．2．5．1 引物的初步筛选18
- 2．2．5．2 利用国外四个品种对初选引物的验证18
- 2．2．5．3 利用中苜一号的F_1对所选引物的验证18
- 2．2．5．4 扩增产物的检验18-21
- 3、 试验结果与分析21-32
- 3．1 DNA的提取与检测21-22
- 3．1．1 DNA的提取21
- 3．1．2 DNA纯度的检测21
- 3．1．3 DNA总浓度的测定21-22
- 3．2 RAPD反应体系的优化22-27
- 3．2．1 MgCl_2浓度筛选22-23
- 3．2．2 扩增缓冲液浓度的筛选23
- 3．2．3 dNTP浓度筛选23-24
- 3．2．4 TaqDNA聚合酶用量的筛选24-25
- 3．2．5 模板DNA用量的筛选25
- 3．2．6 引物浓度的筛选25-26
- 3．2．7 dNTP与Mg~（2+）不同浓度梯度配合下的反应效果检验26
- 3．2．8 反应体系稳定性和谱带丰富度的检验26-27
- 3．3 苜蓿耐盐性状RAPD标记引物的筛选27-32
- 3．3．1 引物的初步筛选27-29
- 3．3．2 利用国外四个品种对引物OPD-5的验证29-30
- 3．3．3 利用中苜1号的F_1对OPD-5引物的验证30-32
- 4、 讨论32-33
- 4．1 非特异性谱带的稳定出现是反应体系稳定的直接表现32
- 4．2 亲本代的追踪检测是进行子代检测的依据32-33
- 结论33-34
- 致谢34-35
- 参考文献35-38
- 作者简历38
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