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《内蒙古农业大学》 2002年
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禽白血病病毒J亚群(ALV-J)内蒙株的建立及致瘤机理的研究

成子强  
【摘要】:禽白血病病毒J亚群(Avian Leukosis Virus Subgroup J,ALV-J)是禽白血病/肉瘤病毒群的一个新亚群,是由英国人Payne 于1991首次报道,其主要引起肉种鸡的骨髓细胞瘤病或称骨髓细胞性白血病(Myelcytomatosis or Myeloid Leukosis,ML)。近年来,本病在世界范围内迅速传播,尤其是在1997~1998年对世界养禽业造成了毁灭性的打击,以至于1997~1998年被称为J亚型白血病的灾难年。1999年内蒙古地区首次发现此病,其病理学特征主要是:骨髓、肝、脾、心、肾、睾丸(或卵巢)等组织出现髓细胞样瘤细胞,甚者可见肋骨端或股骨端出现由髓细胞样瘤细胞组成的肿瘤性增生物。后经PCR和ELISA检测确定内蒙地区ML的发生和ALV-J的感染有关。用ALV-J抗体检测试剂盒,经血清学(ELISA)调查发现:内蒙地区肉种鸡ALV-J的感染率在8.33%~28.12%,蛋种鸡ALV-J的感染率为0%。以ML病变明显鸡的肝脏作为组织毒,接种SPF鸡胚成纤维细胞(CEF),培养7天,电镜观察:在培养物的网状细胞泡膜上发现以出芽方式增殖的病毒样凸起。以ALV-J原型株HPRS-103的env gp85基因为基础设计合成引物,分别以自然病例肝组织和感染CEF细胞的基因组DNA为模板,进行PCR扩增,结果获得特异性的ALV-J内蒙株env gp85基因片段,长度为924bp,与HPRS-103 gp85基因长度相等,由以上结果可知,ALV-J病毒内蒙株复制成功。选择经ELISA调查过的部分鸡的肝脏进行PCR发现:PCR的敏感性和精确性都高于ELISA检测,高出的百分率为21.05%。将经PCR鉴定的禽骨髓细胞瘤病毒内蒙株env gp85基因进行分子克隆和序列测定,结果发现gp85基因的预期氨基酸序列与HPRS-103(英国原型株)、SD9901(山东毒株)、ADOL-R5-4(美国毒株)的gp85蛋白及内源性病毒EAV-HP env蛋白的氨基酸同源性分别为97.40%、95.13%、86.69%和85.06%,因此,将此ALV-J 内蒙株命名为NM8761,此毒株的gp85基因的保守性较高。实验性腹腔接种1日龄肉种鸡内蒙株NM8761、NM9996后,定期采血、剖检,直至31周龄时全部剖检完毕;每组攻毒鸡中随机取2只鸡,编号,不剖检,定期采血,以监测同一鸡体内的抗体变化;用ALV-J抗体检测试剂盒检测抗体、用PCR方法检测抗原、用病理组织学方法观察感染鸡的病变。结果发现:ALV-J抗体呈规律性变化,在7~8周龄和18~20周龄时分WP=3别出现一次高峰;在5~7周龄时发病,在10周龄以后发病率上升,出现不同程度的禽骨髓细胞瘤病变;剖检鸡只抗体阳性率0~21.4%,病毒阳性率64.3%~71.4%,发病率46.7%~50.0%。从人工接种鸡的各项结果来看ALV-J内蒙株的致病性较高,人工复制禽骨髓细胞瘤病获得成功。因此,通过ALV-J病毒的细胞培养、电镜观察、PCR扩增、gp85基因的分子克隆及序列测定、回归动物等一系列研究成功建立了ALV-J内蒙株ALV-J-NM8761,ALV-J-NM9996。用克隆的ALV-J内蒙株NM8761 env gp85基因,经纯化试剂盒纯化后,用地高辛(DIG)以随机引物法进行标记,作为探针进行病毒RNA转录的检测及抗原定位的研究。结果显示,原位杂交检测病毒组织嗜性及病毒基因定位结果与免疫组化抗原定位的结果一致:二者都对瘤组织、肝脏、心脏、肾脏的实质细胞、骨髓髓系细胞和卵巢基质中的间质细胞及脾脏红髓内的单核-巨噬细胞有较高的嗜性,原位杂交在核膜及胞浆内、免疫组化在胞膜和胞浆中显示出蓝紫色颗粒的特异性信号,而在法氏囊、胸腺、脑和坐骨神经中检测不到病毒RNA的表达及病毒蛋白。自然感染鸡的病毒核酸检测与抗原定位结果与人工接种鸡相似。由以上结果可推断致瘤机理为:ALV-J前病毒插入靶细胞内基因组原癌基因附近位点是髓细胞发生癌变的必要条件之一;病毒量的增多是其他非靶细胞发生癌变的必要条件之一。病毒首先侵害骨髓细胞,其次是心脏和肝脏,再次是肾、卵巢、脾、肺、小肠等组织器官。髓细胞样瘤细胞可以从骨髓通过Haversian系统和 Volkman's通道在骨膜附近扩散与增生,并可通过血液循环向其他组织转移。
【学位授予单位】:内蒙古农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:S852.65

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