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鸡包涵体肝炎病原特性及肿瘤坏死因子α在其发病机理中作用的研究

王凤龙  
【摘要】: 鸡包涵体肝炎(IBH)是由禽腺病毒(AAV)引起雏鸡的一种急性传染病。该病自1963年由Helmbolelt和Frazier在美国的鸡群发现以来,已在世界许多国家流行,给养鸡业造成了重大的经济损失。我国于1985年首先在辽宁省发现该病,随后在其他省市自治区相继发现1BH的流行,1991年在内蒙古呼和浩特地区发生1BH。本研究课题应用采集的鸡包涵体肝炎自然病例的肝组织,通过SPF鸡胚传代和鸡胚肾原代细胞培养,分离到一株病毒Hb,该病毒株的复制可被5-溴尿嘧啶-2脱氧核苷抑制,对乙醚和氯仿有抵抗力,表明Hb株的核酸类型是DNA,且无脂质囊膜。Hb株对酸有抵抗力,对碱和热敏感。电镜观察表明,病毒粒子呈球形,直径为70-90nm。以上结果证明分离病毒Hb株为禽腺病毒,Hb株用标准毒株AAV-2,3,4,5,8型的分型血清进行中和试验表明为禽腺病毒8型。回归试验表明,Hb株能引起雏鸡出现鸡包涵体肝炎的病变群,其致病性较强。通过上述研究,成功地分离到一株鸡包涵体肝炎病毒,建立起了鸡包涵体肝炎病毒内蒙株FAV-Hb。应用FAV-Hb株试验感染SPF鸡胚,通过透射电镜对感染鸡胚肝脏的观察,表明FAV-Hb株可引起鸡胚肝细胞内形成三种类型的包涵体,即非病毒性中电子密度包涵体,病毒性包涵体和非病毒性高电子密度包涵体,各型包涵体均可见于胞核或胞浆内,但胞核是包涵体首先形成的部位,核内包涵体通过核膜进入胞浆。各型包涵体在其形成过程中有较密切的关系。应用限制酶HindⅢ和Ecorl双切鸡包涵体肝炎病毒Hb株的六邻体蛋白基因片段重组质粒,得到大小559bp的基因片段,经地高辛标记制备DNA探针,其灵敏度为0.1-0.3ng/ul。用该探针对感染鸡包涵体肝炎病毒的雏鸡肝组织进行原位杂交,结果表明病毒经口感染后12小时肝细胞内出现病毒的复制,3-7天时病毒复制明显,9-16天病毒复制减弱。原位杂交表明鸡包涵体肝炎病毒主要定位于核内,同时也可进入胞浆中。为了研究肿瘤坏死因子在鸡包涵体肝炎发病机理中的作用,本研究用卡介苗(BCG)和大肠杆菌内毒素(LPS)经静脉注射健康鸡诱生TNFα,用微量细胞病变法经L_(929)细胞检测外周血清、外周血白细胞和脾脏TNFα的活性,表明外周血清TNFα活性最高,脾脏TNFα活性次之,外周血白细胞TNFα活性最弱。应用LPS诱生的鸡培养白细胞提取RNA,参考几种动物的TNFα保守序列设计一对引物,以提取的培养白细胞RNA为模板,应用RT-PCR扩增目的基因片段,将PCR产物与PUC_(19)连接,转化到大肠杆菌DH_(52)进行分子克隆,对提取的重组质粒经PCR鉴定和酶切鉴定,表明成功克隆出一段TNFα基因片段,其长度与预计相符为576bp。对鸡肿瘤坏死因子的诱生、活性测定、 基因片段的分子克隆及序列测定,为 TNF a在鸡疾病中作用研究,以及 TNP o的全 序列分析,基因表达,核酸探针制备提供了条件。以上述研究为基础,本课题对 鸡包涵体肝炎 TNF o的动态变化、TNP o的 mRNA表达水平及细胞凋亡做了较详细 的研究。结果表明,FAV-Hb感染后第 3天在外周血开始测出 TNF Q活性,以后逐 渐上升,第4天达到小的峰值,随后下降,第13天基本消失,并持续到第16天, 从 21天 TNF a活性又开始回生,第 46天时达到最高峰,以后缓慢下降。在感染 鸡脾脏 TNF a活性的变化规律与外周血基本一致。应用地高辛标记 TNF o基因片 段,制备核酸探针,通过核酸原位杂交成功地检测了鸡包涵体肝炎病毒感染鸡的 组织细胞 TNF Q的 InRNA表达水平。研究结果表明,Hb株感染雏鸡后,在肝脏、 脾脏、胸腺、法氏囊和盲肠扁桃体中能检测到一定数量的 TNF a的 mRNA信号,其 中在5下天和3666天时阳性细胞数量较多,其它感染时间阳性细胞少,阳性信 号弱,甚至检测不到阳性信号。病理组织学观察证实,FAV十b感染后,从第1天 到第56天,感染雏鸡肝脏的枯氏细胞、脾脏、胸腺、法氏囊和盲肠扁桃体的网状 细胞表现出不同程度的活化增生,其增生程度与外周血及脾脏 TNF Q活性和 TNF a的 IuRN表达水平基本一致。应用原位末端标记方法,对试验感染 F^V-Hb的雏 鸡肝脏和胸腺细胞的凋亡检测,表明鸡包涵体肝炎可出现肝细胞和胸腺细胞的凋 亡过程,且多数凋亡细胞核结构完整,处于早期凋亡阶段,少部分凋亡细胞核破 碎或核浓缩。本研究揭示了 FAV-Hb感染可诱导鸡 TNF Q的表达和分泌水平升高, 并引起细胞凋亡,TNF a在鸡包涵体肝炎的发病机理中具有重要作用。


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