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J亚群禽白血病病毒内蒙株的分离鉴定及其部分分子生物学特性的研究

杨玉莹  
【摘要】: 本研究从曾见典型ML病例的内蒙古某肉种鸡场淘汰肉种鸡和山东一例骨髓性白血病(Myeloid Leukosis,ML)肉种鸡病例中,分离出两株J亚群禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus Subgroup J,ALV-J)。利用PCR和间接免疫荧光反应进行鉴定,两株J亚群禽白血病病毒可以被两对ALV-J特异性引物扩增(特异条带约2.2kb和545bp),且在特异性单克隆抗体JE9的间接免疫荧光检测中呈现强阳性荧光反应。负染色电子显微镜和免疫电子显微镜观察显示,两株ALV-J具有禽白血病病毒的典型形态特征,分别命名为J亚群禽白血病病毒IMC_(10200)株和SDC_(2000)株。将分离毒株回归感染肉鸡,21周龄时特异性引物PCR抽查检测,抽查感染鸡全部为阳性;42周龄后出现典型ML病例。 分离毒株囊膜基因和3′端非编码区测序分析表明,ALV-J IMC_(10200)株和SDC_(2000)株此段DNA的同源性为97.1%。将囊膜基因翻译为氨基酸序列,两株病毒囊膜前体蛋白氨基酸序列达99%,分子量分别为56658.60 dalton、56704.58 dalton;与国内ALV-JSD_(9901)和YZ9901株同源性达93.7%~96.2%,与原型株HPRS-103有89.9%/91.2%的同源性。生物进化树分析显示,在已发表ALV-J毒株中IMC_(10200)株和SDC_(2000)株的变异幅度位于ADOL-R5-4株和1696株之间。IMC_(10200)株和SDC_(2000)株env变异主要发生在gp85的hr1和hr2区,并在囊膜前体蛋白氨基酸序列169位Jameson-Worlf抗原表位优势显著升高,有可能产生新的潜在抗原位点。3′端非编码区内,两株病毒rTM和E组分不同程度缺失。 对ALV-J IMC_(10200)株囊膜基因和3′端非编码区进行克隆,并以克隆的重组质粒pGEM-IMC2.2为模板进一步扩增克隆IMC_(10200)株gp85基因。研究中采用Bac-to-Bac杆状病毒真核表达系统(非融合蛋白性表达载体pFastBacl)在Sf9细胞中表达了IMC_(10200)株gp85基因。表达物拥有ALV-J病毒的抗原特异性,与ALV-J JE9单克隆抗体有强的间接免疫荧光反应。Western blotting结果分析表明,表达物分子量约54kD。 为深入探讨ALV-J的亚群特性,本研究利用ALV-J gp85基因两侧的序列片段为引,物从正常SPF蛋鸡、商品肉鸡和DF1细胞基因组中完整地扩增了内源性类ALV-J gp85基因。肉鸡和DF1细胞内源性类ALV-J gp85基因同源性达99.9%;SPF蛋鸡内源性类ALV-J gp85基因与肉鸡和DF1细胞的内源性类ALV-J gp85基因之间同源性达95.6%、95.3%。三种不同来源的内源性类ALV-J gp85基因DNA与IMC_(10200)株ALV-J的gp85基因的同源性分别为91.8%、94.1%、94.0%;与ALV-J原型株HPRS-103 gp85基因的同源性分别为95.6%、98.3%、99.9%。内源性类ALV-J gp85序列与外源性ALV-J gp85基因具有相似或一致的ORF和Jameson-Worlf抗原表位优势。这一结果显示了J 亚群ALV与宿主内源性反录病毒的密切关系。 J亚群禽白血病病毒IMC1020。株和 SDC20*株的分离鉴定、IMC1020。株gP8)基因 表达以及内源性类 ALVJ gp8)基因的研究与分析,为深入了解 ALVJ的生物学特性、 致病机理等奠定了基础,也对开展我国ALVJ的诊断和预防有着重要的现实意义。


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